Home / Summaries / Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods and Clinical Applications / western-geimmobiliseerde-dna

Analysis and Characterization of Nucleic Acids and Proteins

Q: Wat is de hybridisatietechniek Western blot?

Western blot: Het geïmmobiliseerde doelwit voor een Western-blot is eiwit . Er zijn veel variaties op Western blots. Over het algemeen wordt serum, cellysaat of extract gescheiden op SDS-polyacrylamidegels ( SDS-PAGE ) of iso-elektrischfocusseergels (IEF). DTT of 2-mercaptoethanol kan worden gebruikt om eiwitten te scheiden in subunits (reductie disulfide bindingen). 5-20% polyacrylamide gels

Q: Wat zijn de detectiemethoden van een gebonden probe in Southern blot?

Radioactieve of chemiluminescente detectie blootstelling aan autoradiografie-film Chromogenische detectie direct op het blot Fluorescent

Q: Hoe gaat de detectie van Western blot?

Target eiwit gebonden aan primair antilichaam (probe) , die weer gebonden is aan een secundair antilichaam die gelabeled is.

Q: Wat is het verschil tussen dot blotting en reverse dot blot?

Voor dot- of slot-blots wordt het doel-DNA of -RNA direct op het membraan gedeponeerd. Er zijn verschillende apparaten ontworpen, sommige met vacuümsystemen, om het doelwit op het membraan af te zetten. Een pipet kan worden gebruikt voor procedures waarbij slechts enkele monsters worden getest. Voor dot-blots, de doel wordt gedeponeerd in een cirkel of stip. Voor slotblots, het doel wordt in een langwerpige staaf geplaatst. Sleuf blots zijn nauwkeuriger voor kwantificering door densitometrie scannen omdat ze de fout elimineren die kan optreden van scannen door een cirkelvormig doel. Als de doorsnee van het gescande gebied niet exact hetzelfde is van het ene monster tot het andere, kunnen vergelijkende resultaten onnauwkeurig zijn. Dot blots zijn handig voor meerdere kwalitatieve analyses waar veel doelen worden vergeleken, zoals mutatieanalyses . Reverse dot blot , waarin verschillende probes zitten geïmmobiliseerd op het substraat, en het testmonster is gelabeld voor hybridisatie met de geïmmobiliseerde probes. In deze configuratie kan de terminologie verwarrend zijn. Geïmmobiliseerde probe wordt soms het doel genoemd, en het gelabelde monster DNA, RNA of eiwit wordt genoemd de probe. Ongeacht de benaming, het algemene idee is dat een bekende sequentie wordt geïmmobiliseerd op een bekende locatie op de blot, en de hoeveelheid monster die hybridiseert ernaar wordt bepaald door het signaal van het gelabelde monster. Samenvattend ligt het belangrijkste verschil tussen een dot-blot en een omgekeerde dot-blot in de volgorde van immobilisatie en hybridisatie . Bij een dot-blot wordt het doelmonster eerst geïmmobiliseerd , gevolgd door hybridisatie met een gelabelde probe. Bij een omgekeerde dot-blot worden de capture-probes eerst geïmmobiliseerd en vervolgens wordt het gelabelde doelmonster gehybridiseerd met de geïmmobiliseerde capture-probes.

7 important questions on Analysis and Characterization of Nucleic Acids and Proteins

Kan je met een blunt end ligeren met een sticky end?

Ja, maar het proces is uitdagender. Om de ligatie te vergemakkelijken:

Blunt omgezet naar sticky door ligatie aan synthetische adapters (de synthetische adapters sluiten aan bij de blunt end)
Sticky omgezet naar blunt met nuclease of polymerase

Wat is de hybridisatietechniek Western blot?

Western blot: Het geïmmobiliseerde doelwit voor een Western-blot is eiwit. Er zijn veel variaties op Western blots.

Over het algemeen wordt serum, cellysaat of extract gescheiden op SDS-polyacrylamidegels (SDS-PAGE) of iso-elektrischfocusseergels (IEF).
DTT of 2-mercaptoethanol kan worden gebruikt om eiwitten te scheiden in subunits (reductie disulfide bindingen).
5-20% polyacrylamide gels

Wat zijn de detectiemethoden van een gebonden probe in Southern blot?

Radioactieve of chemiluminescente detectie blootstelling aan autoradiografie-film
Chromogenische detectie direct op het blot
Fluorescent

Wat zijn applicaties van Southern blot?

Genetica, oncologie (translocaties, genherschikkingen)
Typing/classificering van organismen
Klonen/verificatie van gekloond DNA
Forensisch, ouder testing (RFLP, VNTR)

Hoe gaat de detectie van Western blot?

Target eiwit gebonden aan primair antilichaam (probe), die weer gebonden is aan een secundair antilichaam die gelabeled is.

Wat is het verschil tussen dot blotting en reverse dot blot?

Voor dot- of slot-blots wordt het doel-DNA of -RNA direct op het membraan gedeponeerd. Er zijn verschillende apparaten ontworpen, sommige met vacuümsystemen, om het doelwit op het membraan af te zetten. Een pipet kan worden gebruikt voor procedures waarbij slechts enkele monsters worden getest. Voor dot-blots, de doel wordt gedeponeerd in een cirkel of stip. Voor slotblots, het doel wordt in een langwerpige staaf geplaatst. Sleuf blots zijn nauwkeuriger voor kwantificering door densitometrie scannen omdat ze de fout elimineren die kan optreden van scannen door een cirkelvormig doel. Als de doorsnee
van het gescande gebied niet exact hetzelfde is van het ene monster tot het andere, kunnen vergelijkende resultaten onnauwkeurig zijn.
Dot blots zijn handig voor meerdere kwalitatieve analyses waar veel doelen worden vergeleken, zoals mutatieanalyses.

Reverse dot blot, waarin verschillende probes zitten geïmmobiliseerd op het substraat, en het testmonster is gelabeld voor hybridisatie met de geïmmobiliseerde probes. In deze configuratie kan de terminologie verwarrend zijn.
Geïmmobiliseerde probe wordt soms het doel genoemd, en het gelabelde monster DNA, RNA of eiwit wordt genoemd
de probe. Ongeacht de benaming, het algemene idee is dat een bekende sequentie wordt geïmmobiliseerd op een bekende locatie op de blot, en de hoeveelheid monster die hybridiseert ernaar wordt bepaald door het signaal van het gelabelde monster.

Samenvattend ligt het belangrijkste verschil tussen een dot-blot en een omgekeerde dot-blot in de volgorde van immobilisatie en hybridisatie. Bij een dot-blot wordt het doelmonster eerst geïmmobiliseerd, gevolgd door hybridisatie met een gelabelde probe. Bij een omgekeerde dot-blot worden de capture-probes eerst geïmmobiliseerd en vervolgens wordt het gelabelde doelmonster gehybridiseerd met de geïmmobiliseerde capture-probes.

Wat is comparatieve genomische hybridisatie (CGH)?

CGH is een methode voor het analyseren van kopienummervariatie (CNV) in DNA.
Geïmmobiliseerde, gedenatureerde normale chromosomen
Test- en referentie-DNA worden gelabeld door opname van nucleotiden die covalent aan fluorescerende kleurstoffen zijn gehecht.
Kleur test DNA = meer test dan referentie = amplificatie
Kleur referentie DNA = meer referentie dan test = deletie
CGH kan zowel met FISH als microarray worden uitgevoerd.

The question on the page originate from the summary of the following study material:

Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods and Clinical Applications | 9780803626775 | Lela Buckingham

View summary

A unique study and practice tool
Never study anything twice again
Get the grades you hope for
100% sure, 100% understanding

Remember faster, study better. Scientifically proven.

Topics that are related to Analysis and Characterization of Nucleic Acids and Proteins