Startpagina / Samenvattingen / Class notes - Advanced Biotechnology / dna-nadelen-onderdelen

Biotechnologische technieken

14 belangrijke vragen over Biotechnologische technieken

Wat voor gRNAs maak je voor een volledige knock out?

Voor volledige knock out meerdere gRNAs om geconserveerd domeinen en alle onderdelen uit te schakelen -> frameshift aan begin sequentie, binding en actieve sites.

Waar moet je rekening mee houden met het ontwerpen van een gRNA?

Dit is ook afhankelijk van het soort nuclease en letten op de locatie, specificiteit, activiteit/structuur en moet binden aan het target DNA dat voor de PAM sequentie zit.

Wat zijn de voor- en nadelen van traditioneel kloneren?

Voordelen:

1. Lage kosten
2. Veelzijdig
3. Grootste verschil in vector keuze
4. Directionele klonering kan makkelijk worden gedaan
Nadelen:
1. Gelimiteerde flexibiliteit -> restrictie sites moeten aanwezig zijn
2. Geen modules -> kan niet doorwerken met al bestaande dingen
3. Mogelijke sequentie beperkingen door de aanwezigheid en/of translatie van restrictie site

Hoe werkt Gibson assembly en wat zijn de voor- en nadelen?

DNA-fragmenten (PCR-primer) met 20-40 basenparen die homoloog zijn aan hun einde, kunnen worden geligeerd.

Voordelen:
1. Alle soorten dsDNA-fragmenten kunnen worden gebruikt
2. Geen niet gewilde sequenties bij de juncties
Nadelen:
1. Werkt het best wanneer het wordt gecombineerd met DNA-fragmenten groter dan 200 baseparen
2. Heeft geen modules -> elke keer nieuwe ontwerp maken

Hoe werkt Gateway klonering?

DNA-fragment en donor vector hebben compatibelen att sites.Faag met attP site met attB van E.coli genoom recombineren waardoor een insertie ontstaat in het E.coli genoom waarbij een attL en attR site ontstaat à deze linkers zitten aan je primers voor PCR. Bestaat uit de BP reactie waarbij de entry clone wordt gemaakt en de LR reactie waarbij een expressie clone wordt gemaakt.

Wat zijn de voor- en nadelen van gateway klonering?

Voordelen:
1. Heeft modules
2. Erg efficient
3. Staat klonering voor meerdere genfragmenten toe in één construct
4. Pre-existing collecties (ORFs, vectors, etc.)
Nadelen:
1. Duur
2. Gelimiteerde flexibiliteit
3. Grote attachment sites tussen delen  aan beide kanten altijd die att sites die best groot zijn  kan 5-10 aminozuren langer zijn

Hoe werkt Golden gate kloneren? Wat voor niveaus heb je hier binnen?

Gebruikt type IIS restriction endonucleases die een overhang van 4 baseparen creëren à dit type restrictie-enzymen herkennen een sequentie en knippen vervolgens een aantal basen verderop t.o.v. type II in traditionele cloning die knippen in de herkenningssite. Het maken van een construct wordt gedaan in vier stappen:

1. Level -1: losse onderdelen van een gen componenten zoals de CDS (=transcript) (voor grotere onderdelen)
2. Level 0: gen componenten zoals promoters, CDS en terminator
3. Level 1: standaard gen componenten worden gecombineerd tot een transcript unit
4. Level 2: Combinatie van meerdere transcriptie units

Wat zijn de voor- en nadelen van Golden Gate klonen?

Voordelen:
1. Hoge efficiëntie
2. Lage kosten
3. Hoge flexibiliteit
4. Assembly van multigen constructen
5. Korte sites tussen de onderdelen
6. Maakt gebruik van modules
Nadeel:
1. Type IIS-sites kunnen worden gevonden door het DNA sequenties en moeten worden verwijdert wanneer zij op een ongewilde plek aanwezig zijn

Hoe kan er worden geselecteerd op je kloon?

Gebruik maken van een resistentie gen of fluorescentie markers

Selecteren kan ook op twee manieren tegelijk: resistentie gen en gebruik maken van lacZ gen (aanwezig lacZ = wit, afwezig = blauw) -> dit combineren maakt de aanwezigheid van je resistentiegen ook makkelijk te herkennen

Welke drie methodes heb je voor het transformeren van planten?

i. Indirect: agrobacterium methode -> jouw DNA van een agrobacterium naar een plant inbrengen (meest gebruikt)
ii. Direct: protoplast -> van je planten eerst cellen maken en dit is makkelijk om je DNA in te brengen met chemicaliën
iii. Direct: biolistics = deeltjes schieten waaraan je DNA zit

Welke transformatiemethoden worden voor gebruikt voor bacteriën, dieren en schimmels?

Transformatie voor bacteriën:
i. Chemisch
ii. Electroporatie
Transformatie van dieren:
i. Embryo-mediated transgenesis: met virus of vector
ii. Cell-mediated transgenesis  kiezen wat voor cellen
Transformatie van schimmels
i. Filamentous fungi and yeast -> zelfde soort methoden als voor planten (agrobacteriën, protoplasts en biolistics en bacteriën

Welke twee methoden zijn geschikt voor het screenen van mutanten?

a. Screenen gebaseerd op resistentie of fluorescente markers
i. Kanamycine resistente planten
ii. Mutant phenotype
b. Screenen gebaseerd op de aanwezigheid van de mutatie
i. Totale DNA-extractie en PCR amplificatie -> DNA sequensen zodat je kan zien welke mutaties er plaats zijn gevonden

Hoe kan je checken op off-target effecten nadat er geselecteerd is?

1. Biased screens: op basis van voorspelde off-target mutaties door sequencing
2. Unbiased screens: alleen beschikbaar voor muis en humane cellijnen
a. GUIDE-seq: ): off-target detection based on the incorporation of oligodeoxynucleotides in DSBs followed by NHEJ
b. ii. Chromatin immunoprecipitatie sequencing (ChIP-seq): analyseren van DNA met eiwitten (met dCas9)

Op welke manieren kan het effect van de transgen worden geanalyseerd?

Met een mutant analyse die op meerdere manieren kan worden uitgevoerd:
1. Fenotype analyse
2. mRNA expressie analyse (qPCR/RNA-seq)
3. Eiwit expressie analyse (Western Blot)

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

Advanced Biotechnology

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding

Biotechnologische technieken

14 belangrijke vragen over Biotechnologische technieken

Wat voor gRNAs maak je voor een volledige knock out?

Waar moet je rekening mee houden met het ontwerpen van een gRNA?

Wat zijn de voor- en nadelen van traditioneel kloneren?

Hoe werkt Gibson assembly en wat zijn de voor- en nadelen?

Hoe werkt Gateway klonering?

Wat zijn de voor- en nadelen van gateway klonering?

Hoe werkt Golden gate kloneren? Wat voor niveaus heb je hier binnen?

Wat zijn de voor- en nadelen van Golden Gate klonen?

Hoe kan er worden geselecteerd op je kloon?

Welke drie methodes heb je voor het transformeren van planten?

Welke transformatiemethoden worden voor gebruikt voor bacteriën, dieren en schimmels?

Welke twee methoden zijn geschikt voor het screenen van mutanten?

Hoe kan je checken op off-target effecten nadat er geselecteerd is?

Op welke manieren kan het effect van de transgen worden geanalyseerd?

Samenvattingen die gerelateerd zijn aan Biotechnologische technieken

Class notes - Advanced Biotechnology

Massaspectrometrie en Proteomics

Class notes - Membraan & Membraaneiwitten

Class notes - Moleculaire Microbiologie

Exploring humans an introduction to the phil…

Psychologie & sociologie : basiscursus

sheets

Leren veranderen

Overheidsfinanciën

Hoofdzaken socialezekerheidsrecht

Handboek van het Nederlandse staatsrecht

Van de BV en de NV