Startpagina / Samenvattingen / Bioanalyse / dna-buffer-eiwitten

Bioanalyse

81 belangrijke vragen over Bioanalyse

Welke twee buffer-systemen kunnen worden gebruikt?

Continue gel systeem: één gel en één buffer
Discontinue systeem: 2 gelen (stacking gel en separation gel) en verschillende buffers (stacking gel buffer, separation gel buffer en running buffer in tank).

Wat is de functie van bis-acrylamide in PAGE?

Vormt samen met acrylamide een netwerk doordat ze polymeriseren. De poriegrootte van de gel wordt groter als het percentage bis-acrylamide groter wordt, door hoger percentage cross-linker = aantal gram bis-acrylamide / (aantal gram acrylamide + bis-acrylamide)

Wat is de functie van APS in PAGE?

APS is een vrije radicaal, dus erg reactief. Radicalen zorgen voor de polymerisatie van acrylamide en bis-acrylamide.

Hoe perst de stacking gel de eiwitten tot dunne bandjes?

Glycine (in running buffer) is bij een pH van 6.8 neutraal geladen en Cl- is negatief geladen. Cl- ionen zijn klein en lopen sneller door de gel dan de eiwitten die ook negatief geladen zijn (door het SDS). De eiwitten blijven tussen het glycine en Cl- front, waardoor ze tot dunne bandjes worden geperst.

Wat is de functie van de SDS sample buffer (loading dye/buffer)

Oplossing die je toevoegt aan de eiwit monsters voordat je deze in de polyacrylamide gel pipetteert.

Waaruit bestaat de SDS sample buffer (loading dye/buffer)

Tris-HCl buffer pH 6.8 (zelfde als stacking gel buffer), SDS, glycerol, broomfenolblauw, beta-mercaptoethanol (extra toevoegen)

Wat is de functie van glycerol in de SDS sample buffer?

Glycerol is een dikke gel-achtige oplossing die ervoor zorgt dat de eiwitten naar de bodem van de welletjes zakken. Maakt het laden van de eiwitsamples makkelijker

Wat is de functie van broomfenolblauw in de SDS sample buffer?

Broomfenolblauw wordt zichtbaar als een lijntje kleurstof, die weergeeft waar de eiwitten zitten in de gel om het runnen van de gel op tijd te kunnen stoppen. Broomfenolblauw bindt niet aan de eiwitten.

Wat is de functie van beta-mercaptoethanol in de SDS sample buffer?

Beta-mercaptoethanol verbreekt zwavelbruggen van eiwitten om de eiwitten te denatureren.

Welke kleurstof wordt gebruikt om de eiwitten zichtbaar te maken bij SDS-PAGE

De eiwitten in een SDS-PAGE gel worden gekleurd met Coomassie brilliant blue

Welke 2 protein assays worden vaak gebruikt?

Lowry en BCA

Hoe werkt de Lowry assay?

Cu2+ bindt aan de eiwitten. Het koper-eiwit complex reageert met folin reagens waardoor een kleuromslag plaatsvindt.

Hoe werkt de BCA assay?

Cu2+ bindt aan de eiwitten, waardoor Cu+ ontstaat. Cu+ reageert met BCA tot een paars complex.

Wat is het doel van isoelektrische focusering?

Het scheiden van eiwitten op basis van lading.

Wat is het isoelektrisch punt (pI)?

De pH waarbij de netto-lading van het hele eiwit nul is. Bij deze pH zullen de eiwitten stoppen met door de gel migreren.

Welke lading heeft een eiwit als de pH boven het isoelektrisch punt ligt?

Het eiwit is dan negatief geladen en zal naar de positieve pool gaan lopen.

Wat is 2D elektroforese?

Het combineren van IEF (scheiding van eiwitten op basis van lading) gevolgd door SDS-PAGE (scheiding van eiwitten op basis van grootte).

Hoe maak je een agarose gel voor DNA elektroforese?

agar poeder afkomstig uit zeewier wordt opgelost en wordt gekookt om een gel te worden. Laten afkoelen voor het gieten.

Welk percentage agarose gel wordt het meest gebruikt bij DNA elektroforese?

Een 1,0% agarose gel, want plasmide DNA is tussen de 500-10.000 bp.

Waaruit bestaat de loading dye/buffer bij DNA elektroforese?

TBE buffer (tris boraat EDTA buffer), glycerol en 2 kleurstoffen (broomfenolblauw, xyleen cyanol, orange G)

Wat is de functie van het glycerol in de loading dye/buffer?

Glycerol zorgt ervoor dat het DNA naar de bodem van het welletje zakt. Maakt het laden makkelijker.

Wat is de functie van de kleurstoffen in de loading dye/buffer?

De kleurstoffen dienen als indicatie waar het DNA zich bevindt in de gel

Wat is de functie van tris/boraat in de TBE buffer?

Tris/boraat zorgt ervoor dat DNA negatief geladen blijft en oplosbaar in water blijft.

Wat is de functie van EDTA in de TBE buffer?

EDTA remt de enzymen (o.a. knipenzymen, nucleases)

Welke kleurstof wordt gebruikt om het DNA zichtbaar te maken bij DNA elektroforese?

De agarose gel wordt gekleurd met Midori green om de DNA bandjes zichtbaar te maken. Wel handschoenen aan, want kan binden aan eigen DNA.
Oude methode: ethidiumbromide (EtBr) = carcinogeen, bindt aan eigen DNA.

Wat is het voordeel van Western blot t.o.v. SDS-PAGE?

SDS-PAGE is niet specifiek, want er worden allerlei eiwitten aangetoond. Western blot is wel specifiek: je toont 1 eiwit aan d.m.v. antilichamen.

Welke stappen zijn er bij western blot?

SDS-PAGE, blotten, blocken en eiwitdetectie

Welke typen membranen zijn er voor western blot?

De membranen binden aminozuren, niet specifiek (dus handschoenen aan, anders binden eiwitten van je handen aan het membraan)
- Polyvinyldenedifluoride (PVDF) membraan: kan meer eiwitten binden, sensitiever, steviger, hydrofoob (dus moet eerst behandeld worden met methanol).
- Nitrocellulose membraan: hydrofiel, kan gelijk eiwitten binden

Welke buffer wordt gebruikt tijdens het blotten?

Transfer buffer (TBS): tris glycine buffer pH 8.3, 10-20% methanol.

Wat is de functie van methanol in de transfer buffer (TBS)?

Methanol zorgt ervoor dat de eiwitten kunnen binden aan het membraan.

Welke controles kun je uitvoeren om te controleren of het blotten is gelukt?

- De gel kleuren met coomassie blue: op de gel moeten geen bandjes te zien zijn.
- De marker moet zichtbaar zijn op het membraan
- Het membraan kleuren met Ponceau S: aantonen of de eiwitten op het membraan zitten, bindt makkelijk aan membraan en is makkelijk eraf te wassen.

Wat is de functie van het blocken?

Na het blocken zit het hele membraan vol met eiwitten, waardoor de antilichamen die toegevoegd worden alleen kunnen binden aan het bijbehorende eiwit, en niet aan het membraan. Voorkomen van aspecifieke binding

Wat is directe eiwitdetectie?

Er wordt één antilichaam met label (vaak enzym HRP) toegevoegd dat bindt aan het specifieke eiwit. Als er dan substraat (bv. TMB) wordt toegevoegd, ontstaat er een product dat licht uitzendt dat gedetecteerd kan worden.

Wat is indirecte eiwitdetectie?

- Primair antilichaam zonder label toevoegen: bindt aan het specifieke eiwit.
- Wassen met TBST buffer
- Secundaire antilichaam met label toevoegen: bindt aan primaire antilichaam.
- Wassen met TBST buffer (teveel aan antilichaam toevoegen).
- Substraat TMB toevoegen (enzym HRP zet substraat TMB om van kleurloos in blauw).

Welke controles kun je uitvoeren om te controleren of de eiwitdetectie werkt?

Doe je vóór het blocken!
- Stip met het eiwit (antigeen) op het membraan: controle of primaire antilichaam bindt aan het specifieke eiwit.
- Stip met primaire antilichaam op het membraan: controle of secundaire antilichaam bindt aan het primaire antilichaam.
- Stip met secundaire antilichaam op het membraan: controle of het enzym gelabeld aan het secundaire antilichaam werkt om het substraat om te zetten en of het substraat goed is

Wat is de functie van ELISA?

Het aantonen van antilichamen of antigenen

Wat is competitieve ELISA?

Er zijn twee soorten antigenen, waarvan één gecoat zit in het welletje.

Wat zijn de stappen van ELISA?

1) Coating
2) Blocking
3) Detectie

De zwangerschapstest werkt volgens welke vorm van ELISA?

Sandwich ELISA

Wat is de functie van centrifugatie?

Het scheiden van deeltjes van verschillende groottes. Deeltjes slaan neer als gevolg van de middelpuntsvliegende kracht die ontstaat bij het ronddraaien om de as.

Hoe kan je de kracht bij centrifugatie berekenen?

RCF = 11,2 * r * (rpm/1000)^2

Met r = straal in van rotor in cm

Hoe kan er omgerekend worden van RCF naar rpm?

Door middel van de formule of met behulp van een nomogram:
- links rpm
- rechts r (in mm)
- in midden RCF aflezen

Wat is de functie van de nanodrop?

De concentratie DNA meten bij een golflengte van 260 nm.

Waarom wordt DNA gemeten bij 260 nm?

DNA absorbeert het meeste UV-licht bij een golflengte van 260 nm. DNA bevat aromatische ringen met fluorescente eigenschappen.

Bij welke DNA concentratie (enkelstrengs) wordt een extinctie van 1,0 A gemeten?

ssDNA = 33 nanogram/microliter

Wat betekent een extinctie van 0,2 A gemeten bij dubbelstrengs DNA door de nanodrop?

1,0 A = 50 nanogram/microliter bij dsDNA.
0,2 A = 10 nanogram/microliter.
De gemeten concentratie van het DNA is dan 10 nanogram/microliter.

Wat is de werking van de nanodrop?

Pipetteer 1 microliter monster op de monsterplaat en doe de sampling arm naar beneden. De nanodrop bepaalt dan de concentratie DNA bij 260 nm.

Welke waarde van de A260/280 ratio is goed?

Een waarde tussen de 1,8-2,2. Dit betekent dat er 2x zoveel DNA als eiwit is.

Waardoor kun je bij de nanodrop een hoge concentratie DNA meten zonder te verdunnen?

Doordat de nanodrop automatisch een hoge concentratie herkend. De nanodrop neemt dan een weglengte van 0,02 cm i.p.v. 1 cm.

Wat is het doel van chromatografie?

Het scheiden van één bepaald molecuul uit een mix van moleculen.

Uit welke twee fasen bestaat chromatografie?

- Vaste stationaire fase: papiertje waar stoffen op zitten.
- Mobiele fase: vloeistof
De moleculen verdelen zich verschillend over de beide fasen

Welke stappen zijn er bij kolomchromatografie?

1) Equilibreren met juiste buffer
2) Monster opbrengen
3) Wassen
4) Elueren
5) Regenereren

Wat is de functie van het opbrengen van het monster bij kolomchromatografie?

Het monster wordt op de kolom gebracht, waardoor deeltjes van interesse gaan binden aan de kolom.

Wat is de functie van wassen bij kolomchromatografie?

Stoffen die niet binden aan de kolom (= stationaire fase) weg te spoelen

Wat is de functie van elueren bij kolomchromatografie?

Door het toevoegen van zouten (met hogere zoutconcentratie dan de buffer) of door de pH te veranderen.

Toevoegen van zouten om competitie aan te gaan met de deeltjes die gebonden zijn aan de kolom. Stoffen van het monster die eerst gebonden waren aan de kolom laten 1 voor 1 los. Hoe hoger de lading, hoe moeilijker te elueren en hoe meer zout ervoor nodig is om los te krijgen van de kolom.

pH verlagen zorgt ervoor dat negatief geladen deeltjes minder negatief worden, waardoor ze makkelijker van de kolom loslaten

Wat is de functie van regeneren bij kolomchromatografie?

Het schoonmaken van de kolom met een buffer met een hele hoge ionsterke om alle moleculen van de kolom te elueren. Daarna weer equilibreren met start-buffer voordat een nieuw monster kan worden opgebracht.

Wat is de functie van DNA polymerase in de mastermix bij PCR?

DNA polymerase, in dit geval Taq polymerase (kan op hoge temperaturen werken), kan nucleotiden aan primers plakken om DNA strengen te vormen.

Wat is de functie van primers in de mastermix bij PCR?

Primers binden aan enkelstrengs DNA en dienen als startpunt voor Taq polymerase om het DNA te vermenigvuldigen. Primers zijn hele kleine stukjes enkelstrengs DNA.

Hoe kun je primers ontwerpen?

Je hebt 2 DNA strengen, want DNA is dubbelstrengs.
De ene streng loopt van 5'-->3' en de antiparallele streng loopt van 3'-->5'.

Dus:
5'----------------------------------------------3'
3'----------------------------------------------5'

De forward primer wordt van voor naar achter gelezen.
De reverse primer wordt van achter naar voor gelezen.

De forward primer bindt aan de onderste streng (lagging strand), aan de 3' kant: 5'-----3'
De reverse primer bindt aan de bovenste streng (leading strand), aan de 3' kant: 3'-----5'

Uit welke stappen bestaat een PCR reactie?

- Initiële denaturatie
- Cyclus:
1) Denaturatie
2) Annealing
3) Elongatie
- Laatste elongatie
- Koelen

Wat gebeurt er bij de annealing in de cyclus bij PCR?

Primers hechten aan de enkelstrengse DNA strengen

Welke component moet als laatste worden toegevoegd aan de mastermix bij PCR?

Taq polymerase, want dat is de actieve component

Wat bevat de lysis buffer bij DNA isolatie?

Chaotrope zouten: reageren met meest polaire stof (in het begin water, na toevoeging van ethanol met het DNA)
SDS: denatureert eiwitten en breekt het celmembraan af.
Protease: breekt eiwitten af
RNase: breekt RNA af

Wat gebeurt er bij fenol/chloroform extractie bij fenol/chloroform isolatie van genomisch DNA?

Scheiden van DNA en eiwitten door toevoegen van fenol/chloroform: er ontstaan 2 lagen
- hydrofobe laag (fenol/chloroform) onderin
- hydrofiele laag (water) bovenin
DNA is negatief geladen en dus hydrofiel, blijft bovenin zitten.
Eiwitten worden na toevoeging van fenol/chloroform hydrofoob en gaan onderin zitten.

Wat gebeurt er bij ethanol precipitatie bij fenol/chloroform isolatie van genomisch DNA?

Na toevoeging van ethanol is water niet meer de meest polaire stof en gaan de chaotrope zouten uit de lysis buffer reageren met het DNA (dan het meest polair, want DNA meer polair dan ethanol), waardoor het DNA gaat neerslaan.

Wat gebeurt er bij het lyse op kolom aanbrengen en ethanol toevoegen bij isolatie van genomisch DNA én plasmide DNA m.b.v. kolomchromatografie?

De chaotrope zouten in de lysis buffer reageren met de meest polaire stof en verbreken de waterstofbruggen in water. Water kan niet binden aan de silica kolom. Door ethanol toe te voegen, zullen de zouten gaan reageren met het DNA. Het DNA kan nu binden aan de silica kolom.

Wat gebeurt er bij het wassen bij isolatie van genomisch DNA én plasmide DNA m.b.v. kolomchromatografie?

- Eerst wassen met zouten om de eiwitten van de kolom te wassen.
- Centrifugatie
- Tweede was met ethanol om de zouten van de kolom te wassen.
- Natte en droge centrifugatie

Welke stappen zijn er bij de isolatie van plasmide DNA m.b.v. kolomchromatografie?

1) Resuspensie
2) Alkalische lysis
3) Neutralisatie van pH
4) Lyse op kolom aanbrengen en ethanol toevoegen
5) Wassen
6) Elutie

Wat gebeurt er bij de resuspensie bij de isolatie van plasmide DNA m.b.v. kolomchromatografie?

Cellen worden gecentrifugeerd. De pellet wordt opgelost in een resuspensie buffer bestaande uit glucose, Tris-HCl buffer pH 8.0, nucleases, RNase en EDTA: maakt enzymen inactief (o.a. DNA polymerase en nucleases). RNase is nog wel functioneel.

Wat gebeurt er bij de alkalische lysis bij isolatie van plasmide DNA m.b.v. kolomchromatografie?

Cellen kapot maken met NaOH en SDS:
- NaOH: denaturatie van genomisch en plasmide DNA --> enkelstrengs.
- SDS: denaturatie van eiwitten, celmembraan wordt afgebroken.

Wat gebeurt er bij de neutralisatie van pH bij isolatie van plasmide DNA m.b.v. kolomchromatografie?

Toevoegen van kaliumacetaat zorgt ervoor dat DNA terug renatureert naar 2 strengen. Lukt alleen bij plasmide DNA (niet bij genomisch DNA). SDS slaat neer met het gedenatureerde genomische DNA en eiwitten.

Uit welke elementen bestaat circulair plasmide DNA (dsDNA)?

- Origin of replication (ori)
- Multiple cloning side (MCS)
- Promoter
- Antibiotica resistentie gen
- Marker gen

Wat is de functie van de promoter bij plasmide DNA?

Een promoter is nodig voor transcriptie

Wat is het marker gen in pUC18?

lacZ (gen dat codeert voor het enzym beta-galactosidase)

Wat zegt het aantal copy numbers over een plasmide DNA?

Copy number hangt af van ori, grootte van plasmide en groeiomstandigheden.
- Low copy: bacterie met weinig plasmiden (toxiciteit eiwit)
- High copy: bacterie met veel plasmide, meer actief (hoge concentratie plasmide DNA --> meer eiwit).

Hoe kun je aantonen dat de plasmide pUC18 is opgenomen door een bacterie?

- Ampicilline selectie (antibiotica resistentie controle): pUC18 bevat ampicilline resistentie, dus als bacterie pUC18 heeft opgenomen kan de bacterie overleven, anders niet.
- Blue-white screening: toevoegen van X-gal (kan worden afgebroken door beta-galactosidase)
Wel opgenomen: witte kolonies (geen beta-galactosidase en geen afbraak van X-gal, maar wel transcriptie van lac operon.
Niet opgenomen: blauwe kolonies (wel beta-galactosidase, dus afbraak van X-gal tot indolgroepen die aan elkaar plakken en geen transcriptie).

Waarvoor dient het enzym beta-galactosidase waarvoor het lacZ gen codeert?

beta-galactosidase breekt lactose af tot glucose.

Wat is de functie van allolactose?

Allolactose kan de transcriptie van het lac operon aanzetten, maar kan worden afgebroken door beta-galactosidase.

Wat is er kenmerkend aan restrictie-enzymen?

De DNA sequentie die wordt herkend heeft vaak een palindroomsequentie. De sequentie is hetzelfde als de 'reverse complement' DNA sequentie

Welke 2 typen restrictie-enzymen zijn er?

- Blunt end: knipt rechtstreeks door midden
- Sticky end: knipt niet rechtstreeks doormidden. Zorgt voor overhangende delen.

Welke stappen zijn er bij restrictie-analyse?

1) Knippen van een plasmide met bekende restrictie enzymen.
2) Het resultaat weergegeven op een DNA agarose gel.

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

Bioanalyse

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding