Startpagina / Samenvattingen / Biochemische werkwijzen (hoorcollege) / dna-pcr-geladen

PCR-cyclus

26 belangrijke vragen over PCR-cyclus

Waarom is de lengte van een primer belangrijk?

De primers moeten niet te kort zijn. Hoe korter de primer hoe groter de kans er is dat deze aspecifiek bind doordat de sequentie van de primer ook ergens anders in het target DNA nog een keer voorkomt.

Waarom kan de annealing stap samen worden gedaan met de elongatie stap?

Al tijdens de annealing stap begint de synthese van het DNA. Bij 72°C verloopt de DNA synthese het meest efficiënt, omdat dit de optimum temperatuur is voor de meeste thermostabiele DNA polymerases. Ook al is de temperatuur tijdens de annealing stap niet de optimum temperatuur voor het Taq-DNA polymerase begint deze wel al de primers te verlengen. Vanwege de hele korte fragmenten is een gecombineerde annealing en extensie stap dan vaak voldoende

Welke stoffen wil je niet in je PCR product hebben na isolatie?

- nuclease (dnase)
- EDTA -> vangen mg2+ weg. Mg2+ co factor Taq-polymerase.
- SDS
- histonen
- ureum
- agarose
- ijzerionen
- heparine

Waarom wil je geen SDS in je PCR product?

Als resten SDS achterblijven in een opgezuiverd DNA monster kunnen deze tijdens de PCR het enzym Taq DNA polymerase denatureren
bind eiwit en ontrold waardoor er gaten in het membraan komen.

Waarom wil je geen Ureum in je PCR product?

Het kan dus tussen de stabiliserende waterstofbruggen van een eiwit gaan zitten en op die manier het eiwit destabiliseren. Daarnaast verstoort ureum het waternetwerk en verlaagt daardoor hydrofobe interacties. Net zoals SDS kunnen resten ureum achtergebleven in een opgezuiverd DNA monster tijdens de PCR het enzym Taq DNA polymerase denatureren

Op welke manier kunnen we nucleasen/DNAse inactiveren?

Door verhitting of door het toevoegen van een chaotropische zout, zoals guanidine thiocyanaat (GuSCN) of ureum

Wat moet je doen als een PCR niet gewerkt heeft?

Template DNA verdunnen om eventuele remmers ook te verdunnen.

Hoe werkt de algemene principe van de meeste DNA isolatiemethodes?

Bij bacteriën, schimmels, plantencellen etc. dient hiervoor eerst de celwand afgebroken te worden. Vervolgens wordt gebruik gemaakt van de eigenschappen van het DNA die anders zijn dan de eigenschappen van eiwitten en RNA om het DNA te isoleren. Belangrijk is dat alles wat het DNA kan beschadigen of kan storen in de vervolgstappen wordt verwijderd tijdens de isolatieprocedure én dat hetgeen waar je in geïnteresseerd bent, in dit geval het DNA, intact blijft

Waarvoor dient EDTA bij de Plasmide DNA isolatie?

EDTA vangt tweewaardige kationen weg, waaronder ook calcium ionen (Ca2+). Het buitenste membraan van Gram-negatieve bacteriën, zoals E.coli, bevat lipopolysaccharide (LPS) (Figuur 22). LPS is negatief geladen en tussen deze moleculen bevinden zich Ca2+ ionen. Wanneer de ionen worden weggevangen door EDTA, zullen de LPS moleculen elkaar afstoten vanwege hun negatieve ladingen en los laten van het buitenste membraan (outer membraan). Tevens vangt EDTA tweewaardige metaalionen weg die als co-factor dienen voor enzymen, zoals nucleases.

Wat zijn de eigenschappen van de lysis buffer?

Chaotroop reagens (GuSCN).
hoog zout concentratie.
pH 7,1
toxisch, irriterend voor de huid.
inactiveert virussen en andere m.o.
stabiliseert nucleïnezuren door in activatie van nucleases.

Hoe werkt de kolonie PCR?

een bacteriekolonie met behulp van een öse of steriele tandenstoker direct van een kweekplaat wordt afgestreken in de PCR mastermix in het PCR cupje.
extra lange denaturatiestap -> bacteriën kapot koken.
plasmide DNA komt vrij.

Waar kijk je naar bij kolonie PCR?

het hoeft alleen te leiden tot een detectie, niet tot kwantificering van het aantal plasmiden.

34. Een ‘nested’ PCR is gebaseerd op twee PCR reacties na elkaar. Leg het principe uit van een ‘nested’ PCR en hoe dit specificiteitsproblemen kan oplossen.

Een nested PCR kan een oplossing bieden wanneer er erg veel aspecifieke PCR producten gevormd worden tijdens je PCR. Je maakt bij een nested PCR gebruik van twee primersets. Met de eerste primerset wordt een stuk DNA geamplificeerd. De tweede primerset bindt vervolgens specifiek aan het gewenste PCR product geamplificeerd tijdens de eerste PCR.

36. Beredeneer waarom zo’n PCR (vraag 35) nooit een qRT-PCR kan worden.

In principe kun je de tweede PCR van de semi-nested PCR best kwantitatief maken, alleen kun je dit nooit terug herleiden naar de eerste PCR. Door de opzuiveringsstap tussen de eerste PCR en de tweede PCR kun je het resultaat van de tweede PCR nooit terug herleiden naar de oorspronkelijke input.

38. Eén of meerdere van de onderstaande stellingen zijn juist. Welke? Onderbouw je antwoord.
A. cDNA en DNA kunnen gebruikt worden voor een ‘klassieke’ PCR
B. Alleen DNA kan gebruikt worden voor een ‘klassieke’ PCR C. DNA en RNA kunnen gebruikt worden voor een ‘klassieke’ PCR
D. cDNA, DNA en RNA kunnen gebruikt worden voor een ‘klassieke’ PCR
E. plasmide-DNA kan gebruikt worden voor een ‘klassieke’ PCR

Juist
onjuist
onjuist
onjuist
juist

39. Stel men wil een klassieke multiplex-PCR uitvoeren met 4 primersets; waar moet men bij het opzetten van deze PCR op letten als het gaat om de grootte van de PCR producten (amplimeren)?

Om de 4 verschillende PCR producten van elkaar te kunnen onderscheiden is het van belang dat de PCR producten in zekere mate in grote verschillen anders zijn de banden op een agarose gel niet van elkaar te scheiden.

40. Om onderscheid te maken tussen cDNA en verontreiniging van genomisch DNA kan een slimme primerkeuze helpen. Wat voor primerset zou je kunnen kiezen om specifiek genomisch DNA te amplificeren?

Om genomisch DNA te onderscheiden van cDNA kan er gekozen worden voor een primercombinatie waarbij één van de primers over een intron-exon boundary valt (zie het onderstaande figuur). Andersom om specifiek cDNA te amplificeren kan gekozen worden voor een primer die over een exon-exon boundary valt, dit aangezien de introns in het cDNA niet meer aanwezig zijn.

43. Stel je wilt de bovenstaande lysisbuffer gebruiken om expliciet alleen DNA te isoleren, dus géén RNA. Je laat dan de proteïnase K achterwege, maar wat voeg je dan nog extra toe aan de lysisbuffer? En waarom laat je de proteïnase K achterwege?

Het enzym RNase A kan extra toegevoegd worden om het RNA kwijt te raken (af te breken) dat vrijkomt tijdens het openbreken van de cellen. Overigens kan er dan geen EDTA in de oplossing zitten, want ook RNase A wordt hierdoor geremd.

45. Tijdens een DNA/RNA precipitatie met ethanol of isopropanol wordt vaak een zout toegevoegd om de precipitatie te bevorderen. Hiervoor wordt vaak zeer geconcentreerd natriumacetaat (NaAc) gebruikt. Leg uit hoe de hoge concentratie NaAc bijdraagt aan de DNA precipitatie.

Natrium is een positief geladen ion. De backbone van het DNA is negatief geladen. De negatieve lading van het DNA wordt door de toevoeging van NaAc enigszins afgeschermd door de positieve Na+ ionen en zorgt ervoor dat het DNA elkaar niet afstoot, door zijn eigen negatieve ladingen en dus precipiteert in de alcohol. Zonder extra zout toevoeging blijft het DNA negatief geladen en dus eerder in de waterfase van oplossing.

46. In het geval van silica-gebaseerde isolatiemethoden moeten cellen ook eerst gelyseerd worden. Voor deze lysisstap worden vaak chaotrope reagentia gebruikt. Voorbeelden hiervan zijn ureum en guanidine isothiocyanaat (GuSCN). Zoek uit wat een chaotroop reagens in water precies doet en wat voor functie een chaotroop reagens heeft in de lysisbuffer.

Een chaotroop zout maakt het water als het ware minder polair, waardoor eiwitten ontvouwen (denatureren) en vetten beter oplossen.
De chaotrope reagentia in de lysisbuffer zorgen ervoor dat cellen lyseren en eiwitten denatureren, waardoor bijvoorbeeld nucleases uitgeschakeld worden

47. Tijdens het college is de alkalische lysis methode besproken, dit is een veel gebruikte isolatiemethode om plasmide DNA op te zuiveren. In het protocol voor het uitvoeren van de alkalische lysis methode staat vaak nadrukkelijk om niet te vortexen. Wat zou hiervoor de reden kunnen zijn?

Reden hiervoor is dat tijdens de laatste stap van de isolatie de grote stukken bacterieel chromosomaal DNA precipiteren samen met de KDS-eiwitten, terwijl het kleine supercoiled (CCC) plasmide DNA in de oplossing blijft. Wanneer rigoureus wordt gemixt of gevortext kan het chromosomaal DNA in kleinere stukken breken (ook DNA shearing genoemd) en wellicht niet mee precipiteren met de KDS. Het opgezuiverde plasmide DNA raakt dan vervuild met korte chromosomaal DNA fragmenten.

48. Tijdens silica-gebaseerde DNA isolatiemethoden (blz 17), wordt de silicakolom gewassen met een buffer met een hoge zoutconcentratie en ethanol. Leg uit hoe het komt dat ethanol het DNA minder oplosbaar maakt?

Ethanol is veel minder polair dan water, vanwege zijn apolaire C2 staart.
Als er genoeg ethanol aan een waterige oplossing wordt toegevoegd wordt de doorlaatbaarheid voor elektrische velden weer groter en zal de elektrostatische aantrekkingskracht tussen de negatief geladen fosfaatgroepen in de backbone en positieve ionen in de oplossing (bijvoorbeeld Na+) sterk genoeg worden om stabiele ion-bindingen te vormen en slaat het DNA neer.

49. In hoofdstuk 2 wordt gesproken over silica-kolommen en de DEAE (diethylaminoethyl) - kolommen. Wat is het verschil tussen beide soorten kolommen als het gaat om het bindingsprincipe van het DNA?

Bij DEAE kolommen wordt de negatief geladen backbone van het DNA direct gebonden aan de positief geladen DEAE-groepen van de kolom. Het elutieprincipe van de DEAE kolommen is gebaseerd om een combinatie van een hoge pH en een hoge zoutconcentratie.

Bij silica-kolommen word er eerst een zout (na+) toegevoegd die als cation brug dient tussen het silica membraan en de negatief geladen backbone. De silica zelf is ook negatief geladen en zou zonder zoutbrug dus nooit een negatief geladen deeltje binden.

50. Leg uit hoe het komt dat hoe hoger de pH van je elutiebuffer is, hoe minder zout er in hoeft te zitten om het DNA te elueren van de DEAE kolom.

De hoge zoutconcentratie verstoort de binding tussen de positief geladen DEAE groepen en de negatief geladen fosfaatgroepen. De hoge pH zorgt er voor dat de positief geladen DEAE-groepen een H+ afstaan en dus hun positieve lading verliezen. Hoe hoger de pH des te makkelijker het DNA los laat, hoe minder zout toegevoegd hoeft te worden om de nucleïnezuren te elueren.
Bij QA is de hoge pH niet van invloed, omdat QA ook bij hoge pH positief geladen blijft.

51. Het onderstaande figuur geeft de zoutconcentratie weer die nodig is om verschillende soorten nucleïnezuren van een DEAE kolom te elueren bij pH 7. Te zien is dat een 30mer oligo al bij een veel lagere zoutconcentratie los laat dan bijvoorbeeld single stranded DNA (ssDNA) of double stranded DNA (dsDNA). Hoe kun je dit verklaren?

Dit is gemakkelijk te verklaren aan de hand van het aantal negatieve ladingen aanwezig in de backbone. Dit zullen er in verhouding veel meer zijn bij dsDNA dan bij een klein stukje enkelstrengs DNA van 30 nucleotiden lang.

52. Leg uit waarom elueren met een hoge zoutconcentratie voor silica kolommen nu juist niet werkt (vraag 51).

Silica kolommen werken volgens een ander bindingsprincipe. Er vormt zich namelijk een zoutbrug tussen het silicamembraan en de negatief geladen backbone. Een hoge zout concentratie zal de vorming van deze bruggen alleen maar bevorderen waardoor het DNA alleen maar sterker bindt aan de kolom. In het geval van de silica kolommen elueer je het DNA nu juist met een lage zoutconcentratie om zo de zoutbruggen kwijt te raken.

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

Biochemische werkwijzen (hoorcollege)

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Onderwerpen die gerelateerd zijn aan PCR-cyclus

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding

PCR-cyclus

26 belangrijke vragen over PCR-cyclus

Waarom is de lengte van een primer belangrijk?

Waarom kan de annealing stap samen worden gedaan met de elongatie stap?

Welke stoffen wil je niet in je PCR product hebben na isolatie?

Waarom wil je geen SDS in je PCR product?

Waarom wil je geen Ureum in je PCR product?

Op welke manier kunnen we nucleasen/DNAse inactiveren?

Wat moet je doen als een PCR niet gewerkt heeft?

Hoe werkt de algemene principe van de meeste DNA isolatiemethodes?

Waarvoor dient EDTA bij de Plasmide DNA isolatie?

Wat zijn de eigenschappen van de lysis buffer?

Hoe werkt de kolonie PCR?

Waar kijk je naar bij kolonie PCR?

34. Een ‘nested’ PCR is gebaseerd op twee PCR reacties na elkaar. Leg het principe uit van een ‘nested’ PCR en hoe dit specificiteitsproblemen kan oplossen.

36. Beredeneer waarom zo’n PCR (vraag 35) nooit een qRT-PCR kan worden.

39. Stel men wil een klassieke multiplex-PCR uitvoeren met 4 primersets; waar moet men bij het opzetten van deze PCR op letten als het gaat om de grootte van de PCR producten (amplimeren)?

40. Om onderscheid te maken tussen cDNA en verontreiniging van genomisch DNA kan een slimme primerkeuze helpen. Wat voor primerset zou je kunnen kiezen om specifiek genomisch DNA te amplificeren?

43. Stel je wilt de bovenstaande lysisbuffer gebruiken om expliciet alleen DNA te isoleren, dus géén RNA. Je laat dan de proteïnase K achterwege, maar wat voeg je dan nog extra toe aan de lysisbuffer? En waarom laat je de proteïnase K achterwege?

45. Tijdens een DNA/RNA precipitatie met ethanol of isopropanol wordt vaak een zout toegevoegd om de precipitatie te bevorderen. Hiervoor wordt vaak zeer geconcentreerd natriumacetaat (NaAc) gebruikt. Leg uit hoe de hoge concentratie NaAc bijdraagt aan de DNA precipitatie.

47. Tijdens het college is de alkalische lysis methode besproken, dit is een veel gebruikte isolatiemethode om plasmide DNA op te zuiveren. In het protocol voor het uitvoeren van de alkalische lysis methode staat vaak nadrukkelijk om niet te vortexen. Wat zou hiervoor de reden kunnen zijn?

48. Tijdens silica-gebaseerde DNA isolatiemethoden (blz 17), wordt de silicakolom gewassen met een buffer met een hoge zoutconcentratie en ethanol. Leg uit hoe het komt dat ethanol het DNA minder oplosbaar maakt?

49. In hoofdstuk 2 wordt gesproken over silica-kolommen en de DEAE (diethylaminoethyl) - kolommen. Wat is het verschil tussen beide soorten kolommen als het gaat om het bindingsprincipe van het DNA?

50. Leg uit hoe het komt dat hoe hoger de pH van je elutiebuffer is, hoe minder zout er in hoeft te zitten om het DNA te elueren van de DEAE kolom.

52. Leg uit waarom elueren met een hoge zoutconcentratie voor silica kolommen nu juist niet werkt (vraag 51).

Onderwerpen die gerelateerd zijn aan PCR-cyclus

Alcohol precipitatie

Boom extractie technologie

Controle op opbrengst en zuiverheid

Samenvattingen die gerelateerd zijn aan Contaminatie problematiek

Biochemische werkwijzen (hoorcollege)

Diabetes: epidemiologie; pathogenese type 1 …

Biotechnologie

biotech

immuno

speciele bacteriologie

hematologie

klinische chemie

afp sim

virologie 2021

immunologie OP2

AFP