Startpagina / Samenvattingen / Biochemische werkwijzen (hoorcollege) / tm-primers-ta

Primervoorwaarden

9 belangrijke vragen over Primervoorwaarden

Waarom zit er een lengte beperking bij de kwantitatieve PCR?

Hierbij wil je terug kunnen rekenen naar de verhouding van template en product. Hierom mag het target niet groter dan 200 bp zijn zodat het in zijn geheel kan worden verlengd.

56. Voor het berekenen van de Tm (melting temperatuur) geldt de volgende vuistregel: Tm = (aantal G+aantal C) 4 + (aantal A + aantal T)2 Kun je een verklaring geven waarom G’s en C’s met een factor 4 bijdrage aan de Tm, terwijl je voor ieder A’tje en T’tje maar 2 graden rekent?

Tussen een G-C zitten 3 waterstofbruggen en tussen A-T maar 2.

57. Bereken van de onderstaande forward primer en reverse primer de smelttemperatuur. Maak hierbij gebruik van de formule Tm = (aantal G+aantal C)4 + (aantal A + aantal T)2.

Forward primer Tm= (6*G+4*C)*4 + (6*A + 3*T)*2 = 58°C primerlengte=19

GC-gehalte= 10/19*100= 53%

Reverse primer Tm= (4*G+3*C)*4 + (5*A + 7*T)*2 = 52°C primerlengte=19

GC-gehalte= 7/19*100= 37%

58. Voor welke stap in het PCR programma is het van belang om de Tm van de primers te berekenen?

Annealing. Dit is het moment waarin de primers al kunnen gaan binden. Is de annealingstemperatuur te hoog voor één primer dan zal deze niet kunnen binden. Het tegenovergestelde, is de annealingstemperatuur te laag voor de andere primer dan zal deze te makkelijk binden en daarmee aspecifiek binden op plekken in het template DNA waar dit niet bedoeld is.

59. Gebaseerd op de bovenstaande primers, welke Ta zou je nemen als uitgangspunt voor een Ta-optimalisatie?

Eerst de Ta voor iedere primer bepalen.
Hiervoor geldt Ta = Tm - 5°C.
Forward primer Tm = 58°C Ta =53°C
Reverse primer Tm = 52°C Ta =47°C
Bij het uitvoeren van een PCR is de laagste Ta het uitgangspunt voor het bepalen van de annealingstemperatuur. In dit geval dus 47°C.

60. Als je de Tm’s van beide primers vergelijkt, is dit dan een goede primercombinatie?

Nee, dit is geen goede primercombinatie. Het verschil tussen beide is namelijk 6°C. Geadviseerd wordt om niet meer dan 5 °C verschil in Tm tussen beide primers te hebben.

62. Online zijn er verschillende Tm calculators beschikbaar die naast de basensamenstelling van de primers ook allerlei andere factoren meenemen in de berekening van de Tm. Zoals lange GC-herhalingen, maar ook de reactiecondities van de PCR. Afhankelijk van de zoutconcentratie is de Tm hoger of lager. Kun je verklaren waarom in de onderstaande Tm calculator de Tm waardes hoger zijn voor de primers als de zoutconcentratie in de PCR reactie verdubbeld wordt?

K+ en Na+ ionen schermen de negatieve lading van de fosfaatgroepen in de DNA backbone af waardoor de primers makkelijker annealen. Als primers makkelijker annealen is de kans ook groter op aspecifieke binding van primers op verkeerde plekken. Om hiervoor te compenseren kan de Tm om hoog gebracht worden.

64. Noem 3 toepassingen voor het gebruik van primers met een 5’extentie.

Als je mRNA wilt amplificeren.
als je de niet coderende template streng wilt amplificeren.
Inbouwen van een primer annealingsplek voor een volgende PCR reactie
Inbouwen van een herkenningsplaats voor een restrictie enzym. Dit kan handig zijn voor kloneren omdat zo na de PCR reactie het verkregen PCR product geknipt kan worden met het desbetreffende restrictie enzym.
Inbouwen van een korte spacer.

65. Aan de forward primer uit vraag 68 is een 5’-extentie (in geel) geplakt. Wat wordt nu de nieuwe Tm voor deze langere primer?

De Tm blijft in dit geval 58°C, omdat de 5’-extentie niet complementair is aan het template DNA en dus niet hybridiseert aan het target. En hoewel er na verloop van tijd dus wel moleculen zijn die volledig complementair zijn, blijft de annealingtemperatuur toch op 58°C staan.
De annealingtemperatuur is eigenlijk te laag voor dit DNA, maar daarvan is sowieso bekend dat het 100 % complementair is, dus geen aspecifieke binding oplevert.

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

Biochemische werkwijzen (hoorcollege)

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Onderwerpen die gerelateerd zijn aan Primervoorwaarden

Opdrachten artikel

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding

Primervoorwaarden

9 belangrijke vragen over Primervoorwaarden

Waarom zit er een lengte beperking bij de kwantitatieve PCR?

56. Voor het berekenen van de Tm (melting temperatuur) geldt de volgende vuistregel: Tm = (aantal G+aantal C) *4 + (aantal A + aantal T)*2 Kun je een verklaring geven waarom G’s en C’s met een factor 4 bijdrage aan de Tm, terwijl je voor ieder A’tje en T’tje maar 2 graden rekent?

57. Bereken van de onderstaande forward primer en reverse primer de smelttemperatuur. Maak hierbij gebruik van de formule Tm = (aantal G+aantal C)*4 + (aantal A + aantal T)*2.

58. Voor welke stap in het PCR programma is het van belang om de Tm van de primers te berekenen?

59. Gebaseerd op de bovenstaande primers, welke Ta zou je nemen als uitgangspunt voor een Ta-optimalisatie?

60. Als je de Tm’s van beide primers vergelijkt, is dit dan een goede primercombinatie?

64. Noem 3 toepassingen voor het gebruik van primers met een 5’extentie.

65. Aan de forward primer uit vraag 68 is een 5’-extentie (in geel) geplakt. Wat wordt nu de nieuwe Tm voor deze langere primer?

Onderwerpen die gerelateerd zijn aan Primervoorwaarden

Opdrachten artikel

Samenvattingen die gerelateerd zijn aan Contaminatie problematiek

Biochemische werkwijzen (hoorcollege)

Diabetes: epidemiologie; pathogenese type 1 …

Biotechnologie

biotech

immuno

speciele bacteriologie

hematologie

klinische chemie

afp sim

virologie 2021

immunologie OP2

AFP

56. Voor het berekenen van de Tm (melting temperatuur) geldt de volgende vuistregel: Tm = (aantal G+aantal C) 4 + (aantal A + aantal T)2 Kun je een verklaring geven waarom G’s en C’s met een factor 4 bijdrage aan de Tm, terwijl je voor ieder A’tje en T’tje maar 2 graden rekent?

57. Bereken van de onderstaande forward primer en reverse primer de smelttemperatuur. Maak hierbij gebruik van de formule Tm = (aantal G+aantal C)4 + (aantal A + aantal T)2.