Samenvatting: Biomethoden

Lees hier de samenvatting en de meest belangrijke oefenvragen van Biomethoden

• Les 1-3 - Minimal Residual Disease (MRD)

  Dit is een preview. Er zijn 55 andere flashcards beschikbaar voor hoofdstuk 24/11/2017
  Laat hier meer flashcards zien

• Wat is het principe van de Nanodrop?

  De Nanodrop is een spectrofotometer in het ultraviolet (UV) gebied (180-380 nm) en bestaat uit een lichtbron, monochromator (selectie van golflengte), sample, lichtdetector en een computer om het resultaat weer te geven. Het principe berust op de wet van Lambert-beer (A = E * c * l). Hierbij zijn E en l vaste waarden zijn, zodat de concentratie in het sample in direct verband staat met de gemeten absorptie. Hierbij geldt: hoe hoger de gemeten absorptie, hoe hoger de concentratie in het sample.

• Wat is het doel van de MRD proef?

  Het doel van het experiment is om het aantal K562 cellen (tumorcellen) met de BCR-ABl translocatie in een onbekend monster te bepalen met behulp van real-time RT PCR en de Pfaffl methode, door de genexpressie van het BCR-ABl gen te vergelijken met de genexpressie van het GAPDH gen.

• Wat is de functie van DTT en wat betekent de afkorting?

  DTT = dithiothreitol
  DTT is een reductant en kan hierdoor zwavelverbindingen verkregen zodat het mRNA zijn secundaire structuur verliest en lineair wordt. Dan kan het enzym reverse transcriptase er beter bij.

• Wat is de threshold bij de real-time PCR?

  De threshold is de detectiegrens; wordt bepaald door het qPCR apparaat, meestal de waarde waarbij het fluorescente signaal 10x de standaarddeviatie over het gemiddelde van de ruis (baseline) is.

• Wat vertelt de A260/280 ratio?

  De A260/280 ratio geeft de verhouding weer tussen de gemeten absorptie bij 260 nm (RNA/DNA) en 280 nm (eiwitten) en zegt daarmee iets over de zuiverheid van het geïsoleerde RNA/DNA door de contaminatie met eiwitten vast te stellen. Een waarde tussen de 1,8-2,2 is goed. Een waarde onder de 1,8 duidt op contaminatie met eiwitten.

• Wat zijn de kenmerken van M-MLV RT en SuperScript III Reverse transcriptase?

  M-MLV RT = Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase. Het is een retrovirus dat in muizen leukemie veroorzaakt en thermostabieler is dan normaal reverse transcriptase en is ontdekt door Moloney.
  
  SuperScript III Reverse transcriptase is M-MLV RT met een:
  - Verminderde RNAseH activiteit
  - Verhoogde thermostabiliteit: waardoor ook succesvolle cDNA synthese van GC-rijke regio's kan plaatsvinden.

• Wat is de functie van transfer RNA (tRNA)?

  Het tRNA speelt een functie bij de translatie van het mRNA doordat het tRNA met een specifiek gebonden aminozuur (overeenkomend met het anticodon van het tRNA) kan binden op de A-site van het ribosoom, doordat het anticodon complementair is aan een codon op het mRNA.

• Wat is de threshold cycle (Ct-waarde) bij de real-time PCR?

  De Ct-waarde is de eerste cyclus waarbij het verkregen fluorescente signaal boven de detectiegrens (threshold) uitkomt. De Ct-waarde hangt af van de concentratie DNA in het monster. Hoe hoger de concentratie DNA, hoe hoger het fluorescente signaal, waardoor het signaal eerder boven de detectiegrens zal uitkomen. Hierdoor wordt bij een hogere DNA concentratie een lagere Ct-waarde gemeten.

• Wat wordt er door de Nanodrop gemeten bij de verschillende golflengtes (230, 260, 280 en 340 nm)?

  230 nm = concentratie organische stoffen
  260 nm = concentratie nucleïnezuren (concentratie RNA, DNA en vrije nucleotiden)
  280 nm = concentratie eiwitten
  340 nm = achtergrondruis (baseline)

• Waaraan moet een goed huishoudgen voldoen?

  - De expressie van het huishoudgen moet onder alle experimentele condities gelijk zijn (constante expressie in zowel normale cellen als in tumorcellen).
  - De mate van expressie van het huishuidgen moet ongeveer gelijk zijn aan de mate van expressie van het gen van interesse (moeten ongeveer dezelfde Ct-waarden opleveren).
  - De primerefficiënties van de primers voor het huishuidgen en het gen van interesse moeten ongeveer hetzelfde zijn en dan ook het liefst zo efficiënt mogelijk.