Startpagina / Samenvattingen / Class notes - Biomethoden / cdna-pcr-dna

Minimal Residual Disease (MRD)

Q: Welke 3 soorten primers kunnen er worden gebruikt tijdens de cDNA synthese?

- Gen-specifieke primers : alleen het specifieke gen op het mRNA wordt omgezet in cDNA, waarna al het gesynthetiseerde cDNA wordt geamplificeerd (eenstaps cDNA synthese: combinatie van cDNA synthese en qPCR). - Oligo(dT) primers : de primers binden specifiek aan de polyA-staart van mRNA tijdens de cDNA synthese. Daarna wordt slechts ~10% van het gesynthetiseerde cDNA geamplificeerd tijdens de qPCR (tweestaps cDNA synthese). - Random hexameren : de primers binden random, dus niet-specifiek, op verschillende plekken op het mRNA. Daarna wordt slechts ~10% van het gesynthetiseerde cDNA geamplificeerd tijdens de qPCR (tweestaps cDNA synthese).

33 belangrijke vragen over Minimal Residual Disease (MRD)

Wat is minimal residual disease (MRD)?

De minimal residual disease is het minimale aantal tumorcellen dat nodig is om een relapse te krijgen, waarbij de ziekte terugkeert. Met behulp van moleculaire technieken als PCR kan al een zeer klein aantal tumorcellen worden bepaald, zelfs bij volledige remissie, wanneer er geen symptomen aanwezig zijn. Dit is o.a. van belang voor patiënten na een tumorbehandeling om te kijken of de behandeling goed heeft aangeslagen.

Hoe ontstaat de BCR-ABl translocatie?

Bij de BCR-ABl translocatie verplaatst het ABl proto-oncogen van chromosoom 9 naar chromosoom 22, waar het gen aan het BCR-gen wordt gefuseerd. Hierdoor ontstaat het BCR-ABl oncogen op het nieuw gevormde Philadelphia chromosoom. Dit chromosoom met de BCR-ABl translocatie wordt vaak gevonden in patiënten met chronische myeloïde leukemie (CML).

Welke cellen gebruik je tijdens de MRD proef?

- K562 cellen, geïsoleerd uit een patiënt met CML, met de BCR-ABl translocatie.
- Jurkat cellen zonder de BCR-ABl translocatie ('normale' cellen).

Hoe wordt de ijklijn met 0-100% K562 cellen bereid?

Er wordt een celconcentratiereeks gepipetteerd met 0-100% K562 cellen, waar nodig aangevuld met Jurkat cellen, zodat elk monster een totaal aantal cellen van 2 miljoen bevat.

Wat is het principe van de Nanodrop?

De Nanodrop is een spectrofotometer in het ultraviolet (UV) gebied (180-380 nm) en bestaat uit een lichtbron, monochromator (selectie van golflengte), sample, lichtdetector en een computer om het resultaat weer te geven. Het principe berust op de wet van Lambert-beer (A = E * c * l). Hierbij zijn E en l vaste waarden zijn, zodat de concentratie in het sample in direct verband staat met de gemeten absorptie. Hierbij geldt: hoe hoger de gemeten absorptie, hoe hoger de concentratie in het sample.

Wat wordt er door de Nanodrop gemeten bij de verschillende golflengtes (230, 260, 280 en 340 nm)?

230 nm = concentratie organische stoffen
260 nm = concentratie nucleïnezuren (concentratie RNA, DNA en vrije nucleotiden)
280 nm = concentratie eiwitten
340 nm = achtergrondruis (baseline)

Wat vertelt de A260/280 ratio?

De A260/280 ratio geeft de verhouding weer tussen de gemeten absorptie bij 260 nm (RNA/DNA) en 280 nm (eiwitten) en zegt daarmee iets over de zuiverheid van het geïsoleerde RNA/DNA door de contaminatie met eiwitten vast te stellen. Een waarde tussen de 1,8-2,2 is goed. Een waarde onder de 1,8 duidt op contaminatie met eiwitten.

Waardoor wordt de A260/280 ratio beïnvloedt?

Door de pH: een hogere pH leidt tot een lagere eiwitconcentratie door denaturatie van de eiwitten, waardoor de A280 lager wordt. De concentratie bij 260 nm blijft gelijk, waardoor de A260/280 ratio hoger wordt bij een hogere pH.

Hoe wordt de agarose gel en de monsters bereid voor de agarose gelelektroforese?

Bij de analyse van RNA wordt een semi-gedenatureerde 0,8% agarose gel gebruikt, omdat bij RNA bij een semi-gedenatureerde gel scherpere bandjes worden verkrijgen, waardoor minder twijfel ontstaat tussen smeervorming of niet.
- Guanidine thiocyanate (GTH) wordt toegevoegd om het semi-gedenatureerde karakter te verkrijgen. GTH denatureert eiwitten en is een RNAse remmer.

De monsters worden gemengd met formamide voor deze op gel te brengen.
- Formamide stabiliseert het RNA in oplossing.

Welke 3 soorten primers kunnen er worden gebruikt tijdens de cDNA synthese?

- Gen-specifieke primers: alleen het specifieke gen op het mRNA wordt omgezet in cDNA, waarna al het gesynthetiseerde cDNA wordt geamplificeerd (eenstaps cDNA synthese: combinatie van cDNA synthese en qPCR).

- Oligo(dT) primers: de primers binden specifiek aan de polyA-staart van mRNA tijdens de cDNA synthese. Daarna wordt slechts ~10% van het gesynthetiseerde cDNA geamplificeerd tijdens de qPCR (tweestaps cDNA synthese).

- Random hexameren: de primers binden random, dus niet-specifiek, op verschillende plekken op het mRNA. Daarna wordt slechts ~10% van het gesynthetiseerde cDNA geamplificeerd tijdens de qPCR (tweestaps cDNA synthese).

Wat is de functie van DTT en wat betekent de afkorting?

DTT = dithiothreitol
DTT is een reductant en kan hierdoor zwavelverbindingen verkregen zodat het mRNA zijn secundaire structuur verliest en lineair wordt. Dan kan het enzym reverse transcriptase er beter bij.

Wat is de functie van magnesiumchloride in de first strand buffer?

Magnesiumchloride is een co-factor voor alle DNA polymerases, dus ook voor Taq polymerase en reverse transcriptase.

Wat zijn de kenmerken van RNAseOUT?

RNAseOUT is een RNAse remmer en remt de afbraak van het mRNA door RNAses tijdens de cDNA synthese.
- Het is een zuur eiwit, dus mag er geen verandering optreden in temperatuur of pH, want anders denaturatie).
- Non-competitieve remmer voor pancreatic ribonucleases, effectief tegen RNAse A, B, C.

Wat zijn de kenmerken van M-MLV RT en SuperScript III Reverse transcriptase?

M-MLV RT = Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase. Het is een retrovirus dat in muizen leukemie veroorzaakt en thermostabieler is dan normaal reverse transcriptase en is ontdekt door Moloney.

SuperScript III Reverse transcriptase is M-MLV RT met een:
- Verminderde RNAseH activiteit
- Verhoogde thermostabiliteit: waardoor ook succesvolle cDNA synthese van GC-rijke regio's kan plaatsvinden.

Wat is de functie van RNAseH?

RNAseH is het enzym dat ervoor zorgt dat het de streng mRNA van de tijdens de cDNA synthese gevormde RNA-DNA hybride wordt verwijderd.

Waar hangt de efficiëntie van de cDNA synthese vanaf?

- De kwaliteit van het geïsoleerde RNA: hoe meer het geïsoleerde RNA gedegradeerd is, hoe minder cDNA er gesynthetiseerd zal worden.
- GC-gehalte van het geïsoleerde RNA: hoe hoger het GC-gehalte hoe minder cDNA er gesynthetiseerd zal worden, omdat RT moeilijker GC-nucleotiden kan aanhechten omdat daar een sterkere binding voor nodig is (3 waterstofbruggen i.p.v. 2 waterstofbruggen bij AT).
- Contaminatie met organisch oplosmiddel: als tijdens de RNA isolatie het geïsoleerde RNA niet goed wordt gewassen zal er tijdens de cDNA syntese minder cDNA worden gesynthetiseerd, want organische oplosmiddelen belemmeren het enzym RT.

Hoe vindt de qPCR plaats bij de MRD proef?

Met SYBR green als fluorescente stof en twee mastermixen met alle componenten zonder het cDNA: SYBR green supermix met Taq polymerase, magnesiumchloride, dNTPs en de fluorescente stof SYBR green, millipore water en de bijbehorende primers:
- 1 mastermix met primers tegen het BCR-ABl gen.
- 1 mastermix met primers tegen het GAPDH gen.

Wat is het GAPDH gen?

Het GAPDH gen (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) is een huishuid gen dat codeert voor eiwitten die essentieel zijn voor normale celfuncties. Het komt in elke cel in dezelfde mate tot expressie. Het GAPDH gen is hierdoor in de K562 cellen en de Jurkat cellen in dezelfde mate aanwezig, terwijl het BCR-ABl gen alleen in de K562 cellen aanwezig is.

Wat zijn de kenmerken van Taq polymerase?

Taq polymerase is een thermostabiele DNA polymerase.
Het nadeel van Taq polymerase is dat het ook een beetje actief is bij lage temperaturen. Tijdens het opstarten van de PCR kunnen primers niet-specifiek binden, als het Taq polymerase dan al functioneert dan kunnen er aspecifieke producten ontstaan. Dit kan worden tegengegaan door een 'hotstart' PCR te doen. Een hot-start zorgt ervoor dat Taq polymerase niet actief is tijdens het opstarten van de PCR en tijdens de eerste denaturatie stap.

Hoe wordt de fluorescentie gemeten tijdens de real-time PCR?

Tijdens elke cyclus neemt de hoeveelheid amplificatieproduct toe als het gen aanwezig is om het cDNA. De fluorescente stof SYBR green bindt niet-specifiek aan elk stukje dubbelstrengs DNA en neemt dus toe als de hoeveelheid amplificatieproduct toeneemt. De fluorescentie wordt continu gemeten door het qPCR apparaat en wordt uitgedrukt in relative fluorescent units (RFU).

Wat is de baseline bij de real-time PCR?

De baseline is het achtergrondsignaal (ruis); het fluorescente signaal gemeten over de eerste paar cycli (doorgaans cycli 3-15), waarbij nog geen hoeveelheid DNA wordt gemeten.

Wat is de threshold bij de real-time PCR?

De threshold is de detectiegrens; wordt bepaald door het qPCR apparaat, meestal de waarde waarbij het fluorescente signaal 10x de standaarddeviatie over het gemiddelde van de ruis (baseline) is.

Wat is de threshold cycle (Ct-waarde) bij de real-time PCR?

De Ct-waarde is de eerste cyclus waarbij het verkregen fluorescente signaal boven de detectiegrens (threshold) uitkomt. De Ct-waarde hangt af van de concentratie DNA in het monster. Hoe hoger de concentratie DNA, hoe hoger het fluorescente signaal, waardoor het signaal eerder boven de detectiegrens zal uitkomen. Hierdoor wordt bij een hogere DNA concentratie een lagere Ct-waarde gemeten.

Wat is de standaard curve bij de real-time PCR?

De standaard curve (ijlijn) is een 10-voudige verdunningsreeks (steeds 10x minder DNA in het monster) om uiteindelijk de onbekende samples te kunnen kwantificeren en voor bepaling van de primerefficiënties. Het is een grafiek waarbij de gemeten Ct-waarden worden uitgezet tegen het logaritme van de hoeveelheid cellen in het monster. Bij een standaardcurve liggen de Ct-waarden ~3,3 cycli uit elkaar.

Wat is de correlatie coëfficiënt bij de real-time PCR?

De correlatie coëfficiënt is de R2 van de standaard curve (idealiter boven de 0,99) en zegt iets over hoe lineair de standaard curve door de data loopt.

Wat is het Y-intercept bij de real-time PCR?

Het Y-intercept is de snijpunt van de standaard curve met de y-as (dus x=0, vaak de blanco). De gemeten Ct waarde bij de blanco (NTC = no template control) hoort het hoogst te zijn, want de blanco hoort geen DNA te bevatten, waardoor het fluorescente signaal niet snel boven de drempelwaarde (threshold) uit hoort te komen. Meestal ligt de waarde rond de 38-40. Is het Y-intercept laag, dan is er mogelijk sprake van contaminatie van de mastermix met DNA of is er vorming van primer-dimers.

Wat is de exponentiële fase bij de real-time PCR?

De exponentiële fase is de fase waarin het cDNA exponentieel wordt geamplificeerd. Het is belangrijk om tijdens de vroege exponentiële fase te kwantificeren, omdat dan alle componenten nog genoeg aanwezig zijn, het enzym Taq polymerase nog optimaal werkt en de verkregen amplificatieproducten nog in lage hoeveelheid aanwezig zijn, waardoor er nog geen concurrentie is waar de primers aan binden.

Wat is de slope bij de real-time PCR?

De slope is de helling van de standaardcurve (altijd negatief) en zegt iets over de efficiëntie van de reactie (idealiter 100%, dan is de slope -3,32) en de primerefficiënties (idealiter 2).

Wat is absolute kwantificatie?

Er wordt een ijklijn gemaakt van samples met een bekende hoeveelheid copynumbers, waarna het onbekende monster kwantitatief wordt vergeleken met de standaardcurve, waarna het exacte aantal copynumbers in het onbekende monster kan worden bepaald.

Waaraan moet een goed huishoudgen voldoen?

- De expressie van het huishoudgen moet onder alle experimentele condities gelijk zijn (constante expressie in zowel normale cellen als in tumorcellen).
- De mate van expressie van het huishuidgen moet ongeveer gelijk zijn aan de mate van expressie van het gen van interesse (moeten ongeveer dezelfde Ct-waarden opleveren).
- De primerefficiënties van de primers voor het huishuidgen en het gen van interesse moeten ongeveer hetzelfde zijn en dan ook het liefst zo efficiënt mogelijk.

Hoe gaat de uitwerking tijdens de MRD proef?

Met de Pfaffl methode.

Welke 3 methoden kunnen worden gebruikt om de verkregen resultaten van de real-time PCR uit te werken?

- delta Ct-methode: geen sprake van een referentie-gen en ook de primerefficiënties worden niet meegenomen. Daarom de eenvoudigste, maar ook onnauwkeurigste en minst betrouwbare methode.

- delta delta Ct-methode: wel sprake van een referentie-gen, maar de primerefficiënties worden niet meegenomen. Daardoor nauwkeuriger dan de delta Ct-methode, maar onnauwkeuriger dan de Pfaffl methode.

- Pfaffl methode: zowel een referentie-gen als de primerefficiënties worden meegenomen, waardoor er optimaal wordt gecorrigeerd voor verschillen tussen monsters. Deze methode heeft daardoor de voorkeur.

Hoe werkt de delta delta Ct-methode?

- Er wordt gebruik gemaakt van een ideale primerefficiëntie van 2.
- Er worden 2 delta Ct-waarden berekend:
delta Ct controle: Ct.target - Ct.referentie
delta Ct sample: Ct.target - Ct.referentie
- De 2 delta Ct-waarden worden met elkaar vergeleken.
- Ratio = 2^-(delta Ct.sample - delta Ct.controle)
De ratio is een fold induction en zegt iets over hoeveel keer meer (groter dan 1) of hoeveel keer minder (kleiner dan 1) het target gen voorkomt in het sample dan in de controle), waarbij wordt gecorrigeerd voor het verschil in genexpressie van het referentiegen.

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

Biomethoden

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding