Startpagina / Samenvattingen / Class notes - Biomethoden / functie-cellen-fluorofoor

Fluorescent in situ hybridization (FISH)

Q: Waarop berust het principe van FISH?

FISH berust op het principe van fluorescentie . Daarnaast is het in situ , dus in de cel en wordt er gehybridiseerd met een probe om de aanwezigheid of afwezigheid een bepaald stukje DNA aan te tonen (in dit geval een probe die bindt aan het centromeer van chromosoom 1 om numerieke afwijkingen van chromosoom 1 te kunnen detecteren).

Q: Welke 2 soorten fluoroforen zijn er en wat is het verschil tussen beide?

- Intrinsieke fluoroforen : een molecuul dat vanuit zichzelf licht kan absorberen en vervolgens licht kan uitstralen, bv. sommige eiwitten als tryptofaan (komt niet veel voor). - Extrinsieke fluoroforen : een molecuul dat van buitenaf aangestraald moet worden om licht te kunnen absorberen en vervolgens licht uit te stralen (gebonden fluorescent), bv. vaak moleculen met een rigide ringstructuur, want deze kunnen moeilijker van vorm veranderen en hierdoor ook moeilijker photo-bleaching ondergaan.

Q: Geef een flowchart van het FISH practicum weer.

Dag 1: - Prepareren van de cellen met colcemid, KCl en fixatief. - Maken van metafase preparaat d.m.v. spatten. - Voorbehandeling van preparaat met pepsine, formaldehyde en ethanol. - Overnachte hybridisatie met fluorescente probe, met formamide en SSC. Dag 2: - Overmaat aan probe wegwassen met SSC/NP40 en openbreken celkernen. - Dehydratatie met ethanol en fluorescent maken met vectashield/DAPI. - Beoordelen preparaat onder fluorescentiemicroscoop.

18 belangrijke vragen over Fluorescent in situ hybridization (FISH)

Waarop berust het principe van FISH?

FISH berust op het principe van fluorescentie. Daarnaast is het in situ, dus in de cel en wordt er gehybridiseerd met een probe om de aanwezigheid of afwezigheid een bepaald stukje DNA aan te tonen (in dit geval een probe die bindt aan het centromeer van chromosoom 1 om numerieke afwijkingen van chromosoom 1 te kunnen detecteren).

Waardoor heeft het emissie licht minder energie (en dus een grotere golflengte) dan het excitatie licht?

Wanneer het fluorofoor wordt aangestraald met het excitatie licht (hoge energie, dus lage golflengte) dan zal het fluorofoor van de grondtoestand in een hoger excitatieniveau terechtkomen door energie te absorberen. Na de excitatie is het aangestraalde fluorofoor in een onstabiele configuratie, waardoor het fluorofoor snel teruggaat naar het laagste excitatieniveau (excited lifetime), waarbij wat van de aangestraalde energie verloren gaat in de vorm van warmte. Bij terugval van het laagste excitatieniveau naar de grondtoestand wordt de overige energie uitgestraald in de vorm van licht (minder energie, dus hogere golflengte).

Wat gebeurt er wanneer het fluorofoor wordt aangestraald met een andere golflengte dan het excitatiemaximum?

Dan zal niet het emissie maximum veranderen! Er zal dan alleen een verminderde intensiteit zijn van het uitgestraalde licht (een lagere piek bij het emissiemaximum).

Wat is de Stokes shift?

Het verschil in energie en golflengte tussen het excitatiemaximum en het emissiemaximum.
- De stokes shift is karakteristiek en verschilt dus per fluorofoor, maar staat wel vast (en hiermee staat het excitatie en emissiespectrum ook vast).
- Hoe groter de stokes shift, hoe duidelijker en betrouwbaarder het signaal en de detectie zal zijn (bij een kleinere stokes shift is er namelijk veel overlap tussen het excitatiespectrum en emissiespectrum, waardoor er altijd informatie verloren gaat en/of er veel last is van achtergrondruis).

Welke probe wordt werd bij dit practicum gebruikt?

De KBI-20001R probe met als fluorofoor PlatinumBright 550, met een excitatiemaximum bij 550 nm en een emissiemaximum bij 573 nm. De probe bindt specifiek aan het centromeer van chromosoom 1 en kleurt deze rood onder een fluorescentiemicroscoop.

Welke 2 soorten fluoroforen zijn er en wat is het verschil tussen beide?

- Intrinsieke fluoroforen: een molecuul dat vanuit zichzelf licht kan absorberen en vervolgens licht kan uitstralen, bv. sommige eiwitten als tryptofaan (komt niet veel voor).

- Extrinsieke fluoroforen: een molecuul dat van buitenaf aangestraald moet worden om licht te kunnen absorberen en vervolgens licht uit te stralen (gebonden fluorescent), bv. vaak moleculen met een rigide ringstructuur, want deze kunnen moeilijker van vorm veranderen en hierdoor ook moeilijker photo-bleaching ondergaan.

Welke onderdelen van de fluorescentiemicrosoop bevinden zich in een filter cube?

In de filter cube bevinden zich het excited filter, de dichroic beamsplitter (mirror) en het barrier/emissie filter.
- Elke filter cube heeft een andere combinatie aan excited filter en barrier filter, waardoor per fluorofoor het juiste filter cube gekozen moet worden om in de fluorescentiemicroscoop te plaatsen.

Geef een flowchart van het FISH practicum weer.

Dag 1:
- Prepareren van de cellen met colcemid, KCl en fixatief.
- Maken van metafase preparaat d.m.v. spatten.
- Voorbehandeling van preparaat met pepsine, formaldehyde en ethanol.
- Overnachte hybridisatie met fluorescente probe, met formamide en SSC.

Dag 2:
- Overmaat aan probe wegwassen met SSC/NP40 en openbreken celkernen.
- Dehydratatie met ethanol en fluorescent maken met vectashield/DAPI.
- Beoordelen preparaat onder fluorescentiemicroscoop.

Wat is de functie van colcemid?

Om de chromosomen zichtbaar te maken moeten de chromosomen zich in de metafase van de celdeling bevinden, want dan zijn ze maximaal gecondenseerd.
- Colcemid zorgt voor metafase arrestatie door de vorming van het mitotic spindle tijdens de mitose te voorkomen.

Wat is de functie van hypotonische shock (KCl)?

Hypotonische shock verhoogt de osmotische druk in de cellen door het creëren van een hypotonisch milieu in de cellen. Door het hypotonische milieu gaat water de cellen in, waardoor de cel opzwelt. Dit maakt het spatten van de cellen makkelijker, zodat er tijdens het spatten een betere verspreiding van de chromosomen kan worden verkregen.

Wat is de functie van methanol:azijnzuur (3:1)?

Methanol:azijnzuur zorgt voor fixatie van de cellen. Hierdoor blijven de cellen gezwollen en worden de celfuncties gestopt. Door de fixatie zullen de cellen ook blijven hechten aan het objectglas waar ze op worden gespat.

Wat is de functie van spatten?

Door te spatten van ongeveer 40 cm hoogte zullen de cellen openspringen, terwijl de celkernen met chromosomen zich over het objectglas verspreiden.

Wat is de functie van Vectashield/DAPI?

DAPI is een extrinsieke fluorofoor die bindt aan dsDNA en daardoor de gehele chromosomen blauw kleurt onder de fluorescentiemicroscoop.
Vectashield wordt toegevoegd aan de DAPI om photo-bleaching te voorkomen (DAPI stabieler maken in de excited state), waardoor de fluorescentie behouden blijft.

Wat is de functie van 1% gedeioniseerde formaldehyde/1x PBS/50 mM MgCl2-oplossing?

De 1% gedeioniseerde formaldehyde/1x PBS/50 mM MgCl2-oplossing herstelt de morfologie van de chromosomen na het spatten.

Wat is de functie van de ethanol serie (70-90-100%)?

De ethanol serie zorgt voor dehydratie, wat ervoor zorgt dat de kernen met chromosomen ook in een waterig milieu gehecht blijft aan het objectglas.

Wat is de functie van 70% gedeioniseerde formamide/2x SSC?

Formamide is een destabiliserende stof, waardoor het dubbelstrengs DNA bij een lagere temperatuur gedenatureerd wordt tot enkelstrengs DNA. De denaturatie kan door deze oplossing plaatsvinden bij 73 graden i.p.v. de gebruikelijke 95 graden.

Wat is de functie van SSC (saline-sodium citrate)?

SSC is een hybridisatie buffer, welke zorgt voor een hoog ionisch milieu. Door deze buffer wordt een milieu gecreëerd waarin de probe goed kan binden aan het target DNA. Daarnaast zorgt dit milieu ervoor dat er stringent kan worden gewassen.

Wat is de functie van NP-40?

NP-40 is een detergent dat alle membranen openbreekt, ook de kernmembranen, zodat de chromosomen vrijkomen.

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

Biomethoden

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding

Fluorescent in situ hybridization (FISH)

18 belangrijke vragen over Fluorescent in situ hybridization (FISH)

Waarop berust het principe van FISH?

Waardoor heeft het emissie licht minder energie (en dus een grotere golflengte) dan het excitatie licht?

Wat gebeurt er wanneer het fluorofoor wordt aangestraald met een andere golflengte dan het excitatiemaximum?

Wat is de Stokes shift?

Welke probe wordt werd bij dit practicum gebruikt?

Welke 2 soorten fluoroforen zijn er en wat is het verschil tussen beide?

Welke onderdelen van de fluorescentiemicrosoop bevinden zich in een filter cube?

Geef een flowchart van het FISH practicum weer.

Wat is de functie van colcemid?

Wat is de functie van hypotonische shock (KCl)?

Wat is de functie van methanol:azijnzuur (3:1)?

Wat is de functie van spatten?

Wat is de functie van Vectashield/DAPI?

Wat is de functie van 1% gedeioniseerde formaldehyde/1x PBS/50 mM MgCl2-oplossing?

Wat is de functie van de ethanol serie (70-90-100%)?

Wat is de functie van 70% gedeioniseerde formamide/2x SSC?

Wat is de functie van SSC (saline-sodium citrate)?

Wat is de functie van NP-40?

Samenvattingen die gerelateerd zijn aan Capillair elektroforese

Class notes - Biomethoden

Overheidsfinanciën

Van de BV en de NV

Schets van het Nederlandse arbeidsrecht

Internationaal publiekrecht in vogelvlucht

De diagnostische cyclus

Corporate governance

Rechtshandeling en overeenkomst

Recht van de Europese Unie

Industriële productie : het voortbrengen van…

Seksuologie

Geschiedenis van het privéleven : bronnen en…