Startpagina / Samenvattingen / Class notes - Biomethoden / gel-capillair-eiwitten

Capillair elektroforese

Q: Waaruit bestaat een polyacrylamide gel?

Acrylamide en bis-acrylamide (cross-linker), die samen een netwerk vormen aan de hand van een polymerisatie reactie. De polymerisatie gebeurt door het toevoegen van: - TEMED (tetramethyleendiamine): een katalysator; reageert met APS, zodat APS een radicaal wordt (moet als laatste worden toegevoegd!). - APS (ammoniumpersulfaat): wordt een vrije radicaal als TEMED wordt toegevoegd. APS als radicaal zorgt voor de initiatie van de polymerisatie.

Q: Uit welke verschillende buffers bestaat een SDS-PAGE gel?

Een polyacrylamide gel bestaat uit een discontinue buffer systeem (DISC) met verschillende buffers in de gel en in de tank: - Buffer in de tank (running buffer): pH 8,3, Tris-Glycine - Stacking gel buffer: pH 6,8, 0,5 M Tris-HCl - Separation gel buffer: pH 8,8, 1,5 M Tris-HCl

Q: Uit welke 2 verschillende gelen bestaat een SDS-PAGE gel en wat is het verschil tussen beide gelen?

- Stacking gel : 4% acrylamide (grote poriegrootte), pH 6,8, 0,5 M Tris-HCl - Separation gel : 8-12% acrylamide (kleinere poriegrootte), pH 8,8, 1,5 M Tris-HCl

Q: Hoe kunnen de eiwitten na de eiwitelektroforese zichtbaar worden gemaakt?

- Alle eiwitten kunnen worden gekleurd met Coomassie Blue (bindt niet-covalent aan alle eiwitten). Hierbij geldt: hoe intenser de blauwe kleur, hoe meer eiwit, maar deze methode is niet echt kwantificeerbaar. - Om specifiek naar één eiwit te kijken moeten de eiwitten na de gelelektroforese op een membraan worden geblot , waarna antilichamen worden toegevoegd specifiek tegen het eiwit dat je wilt aantonen.

22 belangrijke vragen over Capillair elektroforese

Wat is het principe van eiwit elektroforese?

Het scheiden van eiwitten op basis van grootte in een polyacrylamide gel waarop een elektrisch veld wordt gezet.

Wat is de functie van de stof SDS (sodiumdodecylsulfaat)?

SDS is een negatief geladen molecuul dat de eiwitten ontvouwt door interacties te verbreken, waardoor de eiwitten lineair worden en een uniforme negatieve lading krijgen.

Waaruit bestaat een polyacrylamide gel?

Acrylamide en bis-acrylamide (cross-linker), die samen een netwerk vormen aan de hand van een polymerisatie reactie. De polymerisatie gebeurt door het toevoegen van:
- TEMED (tetramethyleendiamine): een katalysator; reageert met APS, zodat APS een radicaal wordt (moet als laatste worden toegevoegd!).
- APS (ammoniumpersulfaat): wordt een vrije radicaal als TEMED wordt toegevoegd. APS als radicaal zorgt voor de initiatie van de polymerisatie.

Waardoor wordt de poriegrootte van de polyacrylamide gel bepaald?

De poriegrootte wordt bepaald door het percentage acrylamide/bis-acrylamide. De poriegrootte wordt kleiner (en de gel daardoor dikker) als het percentage acrylamide groter wordt.
- Hoe hoger het percentage acrylamide in de stacking gel, hoe kleinere eiwitten van elkaar kunnen worden gescheiden.

Uit welke verschillende buffers bestaat een SDS-PAGE gel?

Een polyacrylamide gel bestaat uit een discontinue buffer systeem (DISC) met verschillende buffers in de gel en in de tank:
- Buffer in de tank (running buffer): pH 8,3, Tris-Glycine
- Stacking gel buffer: pH 6,8, 0,5 M Tris-HCl
- Separation gel buffer: pH 8,8, 1,5 M Tris-HCl

Uit welke 2 verschillende gelen bestaat een SDS-PAGE gel en wat is het verschil tussen beide gelen?

- Stacking gel: 4% acrylamide (grote poriegrootte), pH 6,8, 0,5 M Tris-HCl
- Separation gel: 8-12% acrylamide (kleinere poriegrootte), pH 8,8, 1,5 M Tris-HCl

Wat gebeurt er met de eiwitten in de stacking gel?

De eiwitten worden in de stacking gel tot een dun bandje geperst: glycine uit de running buffer is neutraal geladen bij pH 6,8 en blijft daardoor bovenin de gel (loopt niet van de negatieve pool naar de positieve pool). Cl- ionen uit de stacking gel buffer zijn negatief geladen en klein, waardoor ze snel door de gel naar de positieve pool lopen. De eiwitten worden tussen het glycine en het Cl- front tot een dun bandje geperst, zodat elk sample op hetzelfde moment begint aan de scheiding in de separation gel.

Wat gebeurt er met de eiwitten in de separation/resolving gel?

De eiwitten worden gescheiden op basis van grootte door de kleinere poriegrootte door 'molecular sieving' en elektroforetische mobiliteit: glycine uit de running buffer is bij pH 8,8 negatief geladen, waardoor het glycine nu samen met de Cl- ionen voor de eiwitten uit door de gel naar de positieve pool gaan. De achtergebleven negatief geladen eiwitten worden dan gescheiden op basis van grootte, waarbij de kleine eiwitten sneller door de gel gaan dan de grote eiwitten.

Wat is de elektroforetische mobiliteit?

De elektroforetische mobiliteit is afhankelijk van de snelheid (cm/s) van het deeltje en de kracht van het elektrisch veld (V/cm).

mu = V / E

Elk deeltje heeft een eigen elektroforetische mobiliteit: grotere deeltjes gaan langzamer door de gel en hebben daardoor een kleinere elektroforetische mobiliteit. Dit komt doordat er twee krachten werken op het bewegende deeltje:
- F.el = bewegingskracht / elektrische kracht (= lading * potentiaalverschil)
- F.fric = wrijvingskracht (tegengesteld aan bewegingsrichting)

Hoe kunnen de eiwitten na de eiwitelektroforese zichtbaar worden gemaakt?

- Alle eiwitten kunnen worden gekleurd met Coomassie Blue (bindt niet-covalent aan alle eiwitten). Hierbij geldt: hoe intenser de blauwe kleur, hoe meer eiwit, maar deze methode is niet echt kwantificeerbaar.
- Om specifiek naar één eiwit te kijken moeten de eiwitten na de gelelektroforese op een membraan worden geblot, waarna antilichamen worden toegevoegd specifiek tegen het eiwit dat je wilt aantonen.

Waarvoor staat de afkorting CE?

Capillair elektroforese

Op welke twee manieren kunnen monsters in de capillair worden geïnjecteerd?

- Hydrodynamisch: druk zetten aan de sample kant of vacuüm aan de detectiekant.
- Elektrokinetisch: met een spanningsveld of door middel van de zwaartekracht (detectiekant lager plaatsen dan de sample kant).

Wat voor sample volume kan worden geanalyseerd met capillair elektroforese?

Een voordeel van de capillair elektroforese is dat zelfs monstervolumes zo klein als 5-10 nL kunnen worden geanalyseerd.

Welk voltage wordt doorgaans gebruikt bij capillair elektroforese?

Een gebruikelijke spanning is van 7 tot 10 kV, maar het kan ook oplopen tot 50 kV, afhankelijk van de te scheiden monsters.

Waardoor worden bij capillair elektroforese de geladen deeltjes naar één pool getrokken?

Bij capillair elektroforese is er een elektro-osmotische flow (EOF): een bulk flow van vloeistof met zowel positief geladen, neutrale als negatief geladen deeltjes, welke allemaal naar de kathode (- pool) gaan, doordat de elektro-osmotische flow groter is dan de elektroforetische mobiliteit.

Welk type deeltjes migreren het snelt naar de kathode (- pool)?

Alle componenten van het sample, zowel geladen als neutraal, migreren naar de kathode (- pool).
- Kationen (+ geladen deeltjes) migreren het snelt naar de kathode (- pool), gevolgd door neutrale moleculen en vervolgens anionen (- geladen deeltjes).

Alle componenten worden gescheiden in doorgaans 10-20 minuten.

Hoe vindt detectie van de migrerende deeltjes naar de kathode plaats tijdens capillair elektroforese?

De afzonderlijke componenten worden gedetecteerd door UV- of zichtbare spectrofotometrie, fluorescentie of met behulp van elektrochemische detectiemethoden of massa spectrometrie, met een detector die zich aan het einde van het capillair bevindt.
- Het voordeel van massa spectrometrie is dat het molecuulgewicht en de samenstelling van het sample kan worden bepaald, waardoor meer informatie wordt verkregen.

Welke typen samples kunnen met behulp van capillair elektroforese worden gescheiden?

Zowel aminozuren, peptiden, eiwitten, DNA-fragmenten, geneesmiddelen als metaalionen kunnen worden gescheiden door CE.

Wat zijn de kenmerken van capillair free-zone elektroforese (CZE)?

- Simpele capillair elektroforese met buffer in capillair: met dezelfde buffer in het capillair als in de buffersystemen als in het sample.
- Scheiding vindt plaats op basis van de EOF.
- Wordt gebruikt voor de analyse van kleine ionen en eiwitten.

Wat zijn de kenmerken van capillair gel elektroforese (CGE)?

- In het capillair wordt een gelmatrix gebracht: gel in capillair.
- Scheiding vindt plaats op basis van grootte (erg vergelijkbaar met SDS-PAGE, maar dan in een capillair).
- Hierbij wil je een lage of helemaal geen EOF hebben.
- Wordt gebruikt voor de analyse van DNA.
- Ogston sieving voor de scheiding van kleine DNA fragmenten of reptation voor de scheiding van grote DNA fragmenten (fragmenten moeten eerst van vorm veranderen voordat ze goed door de gel kunnen migreren).

Wat zijn de kenmerken van micellair elektrokinetische chromatografie (MEKC)?

- In het capillair vormen zich micellen in de buffer (bolletjes: ongeladen aan binnenkant en geladen aan buitenkant).
- Lijkt op HPLC.
- Scheiding vindt plaats op basis van de affiniteit van de deeltjes voor de buffer (mobiele fase) en de micellen (stationaire fase).
- De micellen bewegen langzamer naar de detector dan de buffer, dus de deeltjes die veel affiniteit hebben voor de micellen zullen later aankomen bij de detector.
- Wordt gebruikt voor de analyse van kleine moleculen, voedingstoevoegingen of bepaalde geneesmiddelen.

Wat zijn de kenmerken van capillair iso-elektric focussing (CIEF)?

- In het capillair wordt een buffer met een pH gradiënt aangebracht.
- Scheiding vindt plaats op basis van het iso-elektrisch punt (pH waarbij het deeltje het liefst aanwezig is): elk deeltje zoekt zijn ideale pH op in de buffer; daarna volgt de EOF, zodat de deeltjes in volgorde van de verkregen gradiënt aankomen bij de detector.
- Wordt gebruikt voor de analyse van eiwitten die veel op elkaar lijken (iso-vormen), maar een ander iso-elektrisch punt hebben (deeltjes met een hoog IEF eerst).

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

Biomethoden

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding

Capillair elektroforese

22 belangrijke vragen over Capillair elektroforese

Wat is het principe van eiwit elektroforese?

Wat is de functie van de stof SDS (sodiumdodecylsulfaat)?

Waaruit bestaat een polyacrylamide gel?

Waardoor wordt de poriegrootte van de polyacrylamide gel bepaald?

Uit welke verschillende buffers bestaat een SDS-PAGE gel?

Uit welke 2 verschillende gelen bestaat een SDS-PAGE gel en wat is het verschil tussen beide gelen?

Wat gebeurt er met de eiwitten in de stacking gel?

Wat gebeurt er met de eiwitten in de separation/resolving gel?

Wat is de elektroforetische mobiliteit?

Hoe kunnen de eiwitten na de eiwitelektroforese zichtbaar worden gemaakt?

Waarvoor staat de afkorting CE?

Op welke twee manieren kunnen monsters in de capillair worden geïnjecteerd?

Wat voor sample volume kan worden geanalyseerd met capillair elektroforese?

Welk voltage wordt doorgaans gebruikt bij capillair elektroforese?

Waardoor worden bij capillair elektroforese de geladen deeltjes naar één pool getrokken?

Welk type deeltjes migreren het snelt naar de kathode (- pool)?

Hoe vindt detectie van de migrerende deeltjes naar de kathode plaats tijdens capillair elektroforese?

Welke typen samples kunnen met behulp van capillair elektroforese worden gescheiden?

Wat zijn de kenmerken van capillair free-zone elektroforese (CZE)?

Wat zijn de kenmerken van capillair gel elektroforese (CGE)?

Wat zijn de kenmerken van micellair elektrokinetische chromatografie (MEKC)?

Wat zijn de kenmerken van capillair iso-elektric focussing (CIEF)?

Samenvattingen die gerelateerd zijn aan Capillair elektroforese

Class notes - Biomethoden

Overheidsfinanciën

Van de BV en de NV

Schets van het Nederlandse arbeidsrecht

Internationaal publiekrecht in vogelvlucht

De diagnostische cyclus

Corporate governance

Rechtshandeling en overeenkomst

Recht van de Europese Unie

Industriële productie : het voortbrengen van…

Seksuologie

Geschiedenis van het privéleven : bronnen en…