Startpagina / Samenvattingen / Class notes - Eiwittechnologie / eiwit-precipitatie-ammoniumsulfaat

Enzyme kinetics and protein purification - Eiwitzuivering

Q: Welke factoren moeten rekening mee worden gehouden bij eiwitzuivering met de His-tag?

Effect van binding, concentratie van: imidazole (lijkt op His, bindt aan kolom en concurreert met His tijdens elutie) EDTA (complexvormer met Ni2+ en verwijdert de ionen uit de kolom) pH 8 voor binding kolom (lading van His) In zuur milieu (pH 4.5) is er géén binding, His zal dan geprotoneerd worden en dissociëren van de Ni-kolom. Ni2+ ionen worden verstoord door hoge concentratie EDTA of pH DTT (zorgt voor de juiste vouwing van eiwitten en voorkomt oxidatie van vrije S-groepen, reducerende agent, < 1mM) EDTA en DTT kunnen Ni2+ wegvangen of reduceren waardoor er geen binding met de kolom meer plaatsvindt.

Q: Wat is eiwitzuivering (zonder tag) mbv ammonium sulfaat precipitatie ('salting out')?

Ammonium sulfaat bestaat uit twee ionen ammonium en één sulfaation, dit vormt een zout. Beide ionen zijn heel goed oplosbaar . Goed oplosbaar zout: 100% verzadigde oplossing ~4M Goedkoop, extreem zuiver Veel gebruikte differentiële oplossingstechniek Niet permanent gedenatureerd

Q: Wat zijn de voordelen van ammonium sulfaat precipitatie?

Eiwit kan na zuivering weer terugvouwen in zijn oorspronkelijke configuratie Goedkoop en zeer zuiver verkrijgbaar Goed oplosbaar

Q: Wat is het principe van ammonium sulfaat precipitatie als eiwitzuiveringsproces?

Zoutconcentratie wordt langzaamaan verhoogt, totdat er een optimum ontstaat, daarna ontstaat er een overmaat waardoor de eiwitten als eerste neerslaan met het zout 'salting out'. Elk eiwit heeft zijn eigen optimum en moment van neerslaan (precipitatie), daarop berust het proces. Het percentage verzadiging kan worden bepaald.

Q: Hoe kan de hoeveelheid ammoniumsulfaat (gram) dat moet worden toegevoegd aan een bepaald percentage saturatie worden bepaald in ammoniumsulfaat precipitatie als eiwitzuiveringsproces?

Bijv als de cut off 40-60% is, dan moet in stap 1 de hoeveelheid voor 40% saturatie worden bepaald en in stap 2 de hoeveelheid ammoniumsulfaat voor 60% saturatie. Het begin percentage is 0%, bij stap twee is dit 40%. Er kan dan uit de tabel worden afgelezen hoeveel ammoniumsulfaat moet worden toegevoegd in g/L. Als het volume bijv 100 ml initieel en na de eerste stap 120 ml is, dan is 229 g/L = 229 g/L * 0,1 L = 22,9 gram. En 122 g/L = 122 g/L* 0,12 L = 14,6 gram.

Q: Hoe kan de hoeveelheid verzadigde ammoniumsulfaatoplossing (ml) dat moet worden toegevoegd aan een oplossing worden bepaald?

Werkwijze hetzelfde, eiwit van interesse zit in het supernatant (oplossing) in stap 1, tot de 40% cut off , en het eiwit van interesse precipiteert in stap 2, bij de 60% cut off .

Q: Wat betekent een cut off van 40-60% in ammoniumsulfaat precipitatie?

Onder de 40% zit het eiwit van interesse in oplossing, gebruikt om het extract op te schonen Tussen de 40-60% precipiteert het eiwit van interesse, gebruikt om het eiwit te concentreren Boven de 60% is het eiwit van interesse al geprecipiteerd, maar meer andere eiwitten zullen ook precipiteren

Q: Welke formule kan worden gebruikt om uit te rekenen hoeveel milliliter verzadigd ammoniumsulfaatoplossing gebruikt dient te worden?

Va = (Vi(Sf-Si))/1-Sf Va = volume dat moet worden toegevoegd (ml) Vi = initieel volume (ml) Sf = fractie verzadiging (saturatie) (bijv 0,5 voor 50%) Si = fractie initieële verzadiging (bijv 0,3 = 30%)

Q: Wat zijn de stappen in eiwitzuivering uit een homogenaat (verkregen door homogenisatie, zonder tags)?

Ammoniumsulfaat precipitatie Differentiële centrifugatie HPLC/FPLC chromatografie -> resulteert vaak in lagere opbrengsten, lastig om een grote hoeveelheid zuiver eiwit te verkrijgen.

15 belangrijke vragen over Enzyme kinetics and protein purification - Eiwitzuivering

Wat is het elutieproces van eiwitzuivering met een His-tag?

Eiwit moet geëlueerd worden van de NTA-kolom, dat wordt gedaan met imidazole, dit lijkt op de structuur van histidine, hierdoor kan imidazole ook goed binden aan de NTA-kolom en competeert met histidine.

Welke factoren moeten rekening mee worden gehouden bij eiwitzuivering met de His-tag?

Effect van binding, concentratie van:

imidazole (lijkt op His, bindt aan kolom en concurreert met His tijdens elutie)
EDTA (complexvormer met Ni2+ en verwijdert de ionen uit de kolom)

pH 8 voor binding kolom (lading van His) In zuur milieu (pH 4.5) is er géén binding, His zal dan geprotoneerd worden en dissociëren van de Ni-kolom.
Ni2+ ionen worden verstoord door hoge concentratie EDTA of pH
DTT (zorgt voor de juiste vouwing van eiwitten en voorkomt oxidatie van vrije S-groepen, reducerende agent, < 1mM)
EDTA en DTT kunnen Ni2+ wegvangen of reduceren waardoor er geen binding met de kolom meer plaatsvindt.

Wat is eiwitzuivering (zonder tag) mbv ammonium sulfaat precipitatie ('salting out')?

Ammonium sulfaat bestaat uit twee ionen ammonium en één sulfaation, dit vormt een zout. Beide ionen zijn heel goed oplosbaar.

Goed oplosbaar zout: 100% verzadigde oplossing ~4M
Goedkoop, extreem zuiver
Veel gebruikte differentiële oplossingstechniek
Niet permanent gedenatureerd

Wat zijn de voordelen van ammonium sulfaat precipitatie?

Eiwit kan na zuivering weer terugvouwen in zijn oorspronkelijke configuratie
Goedkoop en zeer zuiver verkrijgbaar
Goed oplosbaar

Wat is het principe van ammonium sulfaat precipitatie als eiwitzuiveringsproces?

Zoutconcentratie wordt langzaamaan verhoogt, totdat er een optimum ontstaat, daarna ontstaat er een overmaat waardoor de eiwitten als eerste neerslaan met het zout 'salting out'.
Elk eiwit heeft zijn eigen optimum en moment van neerslaan (precipitatie), daarop berust het proces. Het percentage verzadiging kan worden bepaald.

Hoe kan de hoeveelheid ammoniumsulfaat (gram) dat moet worden toegevoegd aan een bepaald percentage saturatie worden bepaald in ammoniumsulfaat precipitatie als eiwitzuiveringsproces?

Bijv als de cut off 40-60% is, dan moet in stap 1 de hoeveelheid voor 40% saturatie worden bepaald en in stap 2 de hoeveelheid ammoniumsulfaat voor 60% saturatie. Het begin percentage is 0%, bij stap twee is dit 40%. Er kan dan uit de tabel worden afgelezen hoeveel ammoniumsulfaat moet worden toegevoegd in g/L. Als het volume bijv 100 ml initieel en na de eerste stap 120 ml is, dan is 229 g/L = 229 g/L * 0,1 L = 22,9 gram. En 122 g/L = 122 g/L* 0,12 L = 14,6 gram.

Hoe kan de hoeveelheid verzadigde ammoniumsulfaatoplossing (ml) dat moet worden toegevoegd aan een oplossing worden bepaald?

Werkwijze hetzelfde, eiwit van interesse zit in het supernatant (oplossing) in stap 1, tot de 40% cut off, en het eiwit van interesse precipiteert in stap 2, bij de 60% cut off.

Wat betekent een cut off van 40-60% in ammoniumsulfaat precipitatie?

Onder de 40% zit het eiwit van interesse in oplossing, gebruikt om het extract op te schonen
Tussen de 40-60% precipiteert het eiwit van interesse, gebruikt om het eiwit te concentreren
Boven de 60% is het eiwit van interesse al geprecipiteerd, maar meer andere eiwitten zullen ook precipiteren

Welke formule kan worden gebruikt om uit te rekenen hoeveel milliliter verzadigd ammoniumsulfaatoplossing gebruikt dient te worden?

Va = (Vi(Sf-Si))/1-Sf

Va = volume dat moet worden toegevoegd (ml)
Vi = initieel volume (ml)
Sf = fractie verzadiging (saturatie) (bijv 0,5 voor 50%)
Si = fractie initieële verzadiging (bijv 0,3 = 30%)

Wat zijn de stappen in eiwitzuivering uit een homogenaat (verkregen door homogenisatie, zonder tags)?

Ammoniumsulfaat precipitatie
Differentiële centrifugatie
HPLC/FPLC chromatografie

-> resulteert vaak in lagere opbrengsten, lastig om een grote hoeveelheid zuiver eiwit te verkrijgen.

Welke stappen zijn gunstig om zo veel en zuiver mogelijk eiwit te verkrijgen in eiwitzuivering?

Hierbij wordt gebruik gemaakt van berekeningen waarbij de volgende grootheden worden gebruikt:

Opbrengst (yield) = totaal enzym (U)/ initieel totaal enzym (U)
Specifieke activiteit = totaal enzym (U)/ totaal eiwit (mg)
Zuiveringsfactor = specifieke activiteit (U/mg) stap/ initieel specifieke activiteit (U/mg)

U = unit(s)

Wat is differentiële sedimentatie als centrifugatietechniek?

Fractionering op basis van grootte.

Vóór het centrifugeren bevat de buis een gemengde suspensie van grote, middelgrote en kleine deeltjes.
Na centrifugeren op lage snelheid bestaat de pellet voornamelijk uit de grootste deeltjes.
Verdere centrifugatie met hoge snelheid van het supernatant zal een tweede pellet geven, voornamelijk samengesteld uit middelgrote deeltjes.
Een laatste ultracentrifugatiestap verpulvert de resterende kleine deeltjes. Merk op dat alle pellets behalve de laatste een zekere mate van kruisbesmetting zullen hebben

Wat zijn drie verschillende dichtheidsgradiëntcentrifugatie scheidingstechnieken?

Een continue (lineaire) dichtheidsgradiënt,
Een discontinue (stapsgewijze) dichtheidsgradiënt, gevormd door oplossingen van afnemende dichtheid op elkaar te stapelen.
Een eenstaps dichtheidsbarrière (meestal Ficoll®), ontworpen om selectieve sedimentatie van één type deeltje mogelijk te maken. De deeltjes van interesse belanden precies op een specifieke grens.

Je moet dus van tevoren weten welke dichtheid je in geïnteresseerd bent.

Wat zijn verschillende typen gradiënten die kunnen worden gebruikt in dichtheidsgradiëntcentrifugatie?

Glycerol
Sucrose
Ficoll
CsCl

Hoe kunnen Relative Centrifugal Field (RCF) en revolutions per minute (rpm) berekend worden?

RCF = 1.118r(n/1000)^2

RCF is afhankelijk van de snelheid (n) van de rotor (rpm) en de radius (r) van de rotatie (mm).

r 2x zo groot, maakt RCF 2x zo groot.
n 2x verhoogt, maakt RCF 4x verhoogt.
RCF = gravity.
rpm ligt altijd hoger dan RCF.
Bijv met een radius van 11 cm
rpm = 1000 -> RCF = 123 g
rpm = 2000 -> RCF = 492 g
rpm = 3000 -> RCF = 1107 g
rpm = 4000 -> RCF = 1968 g

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

Eiwittechnologie

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding

Enzyme kinetics and protein purification - Eiwitzuivering

15 belangrijke vragen over Enzyme kinetics and protein purification - Eiwitzuivering

Wat is het elutieproces van eiwitzuivering met een His-tag?

Welke factoren moeten rekening mee worden gehouden bij eiwitzuivering met de His-tag?

Wat is eiwitzuivering (zonder tag) mbv ammonium sulfaat precipitatie ('salting out')?

Wat zijn de voordelen van ammonium sulfaat precipitatie?

Wat is het principe van ammonium sulfaat precipitatie als eiwitzuiveringsproces?

Hoe kan de hoeveelheid ammoniumsulfaat (gram) dat moet worden toegevoegd aan een bepaald percentage saturatie worden bepaald in ammoniumsulfaat precipitatie als eiwitzuiveringsproces?

Hoe kan de hoeveelheid verzadigde ammoniumsulfaatoplossing (ml) dat moet worden toegevoegd aan een oplossing worden bepaald?

Wat betekent een cut off van 40-60% in ammoniumsulfaat precipitatie?

Welke formule kan worden gebruikt om uit te rekenen hoeveel milliliter verzadigd ammoniumsulfaatoplossing gebruikt dient te worden?

Wat zijn de stappen in eiwitzuivering uit een homogenaat (verkregen door homogenisatie, zonder tags)?

Welke stappen zijn gunstig om zo veel en zuiver mogelijk eiwit te verkrijgen in eiwitzuivering?

Wat is differentiële sedimentatie als centrifugatietechniek?

Wat zijn drie verschillende dichtheidsgradiëntcentrifugatie scheidingstechnieken?

Wat zijn verschillende typen gradiënten die kunnen worden gebruikt in dichtheidsgradiëntcentrifugatie?

Hoe kunnen Relative Centrifugal Field (RCF) en revolutions per minute (rpm) berekend worden?

Samenvattingen die gerelateerd zijn aan Eiwit domeinen

Class notes - Eiwittechnologie

Reed: Practical Skills in Biomolecular scien…

Exploring humans an introduction to the phil…

Psychologie & sociologie : basiscursus

sheets

Leren veranderen

Overheidsfinanciën

Hoofdzaken socialezekerheidsrecht

Handboek van het Nederlandse staatsrecht

Van de BV en de NV

Socialezekerheidsrecht

Schets van het Nederlandse arbeidsrecht