Startpagina / Samenvattingen / genoom deel 2 / rna-dna-p21

QPCR wercollege

14 belangrijke vragen over QPCR wercollege

Beschrijf aan de hand van het figuur hoe DNA-schade ertoe leidt dat de celcylus wordt geremd.

(Door DNA schade door x-ray zal er een mutatie ontstaan waar door er kinase ontstaan om) de mdm2 en p35 eiwitten (transcriptie factor) te fosforyleren waardoor mdm2 er af gaat en p35 actief wordt. En p21 gen tot expressie komt en een p21 mRNA vormt en zorgt voor een inhibitor eiwit die zorgt dat de dat de G1/S-cdk en S-cdk in actief worden gemaakt en zorgt voor remmingen van de celcyclus. (dit gebeurd bij DNA schade) (mdm2 is een ubiqutine)

Voor welk van de genen p53, p21 en Mdm2 verandert te expressie na optreden van DNA-schade

P21 (bij DNA schade wordt alleen p21 RNA aan gemaakt)

Welke manier wordt in dit experiment gebruikt om DNA-schade te induceren in de cellijnen?

UV-licht

Je gaat uiteindelijk ook de mRNA-expressie bepalen in cellen waarin geen DNA-schade is aangebracht. Waarom is dat?

Als een controleren, hoeveel het eiwit in een normale cel wordt gemaakt. Zo kan je meten of je p21 actief is, omdat je er een verschil tussen zit. Je kan de mate waar in het toeneemt zien.

Hoe voer je een qPCR uit?

Isolatie RNA uit de cellen
synthetiseren van cDNA uit RNA
cDNA vervolgens qPCR uitvoeren

Hoe maak je van RNA cDNA?

Wat is er nodig? Het RNA, reverse transcriptase en een buffer ( hier zitten ook nucleotiden en primers in). Dan wordt de cDNA synthese gestart.

1e stap: priming; hierbij binden de primers aan het RNA, 25 graden celcius
2e stap: reverse transcriptie; hier transcribeert reverse transcriptase nieuw DNA, RNA als template, bij 36 graden.
3e stap: inactivatie van reverse transcriptase; dit bindt plaats als je het sample kort verhit tot 95 graden. Daarna wordt de temperatuur weer omlaag gebracht.

Hoe kan je er achterkomen of je meet waardes juist zijn en wat zijn je controles?

Op het moment dat de qPCR uitwijst dat er veel RNA voor een gen in een bepaald sample aanwezig is, kan dat twee oorzaken hebben:

de expressie van dit gen is in dit sample hoog,
of de RNA-isolatie van dit sample verliep beter dan bij andere samples.

Om een onderscheid te maken tussen de twee wordt gebruik gemaakt van een interne controle. In dit geval wordt ook de expressie van het gen Actine bepaald. Dit is een zogenoemd huishoudgen: een gen waarvan wordt aangenomen dat de expressie gelijk is in alle condities.

Leg uit hoe met behulp van het mRNA-niveau van Actine hier onderscheid tussen gemaakt kan worden.

Maat om te kijken wat de maat is voor mRNA omdat actine in elke cel aanwezig is.

Waarom worden beide replica's minimaal drie keer in een qPCR-plaat meegenomen?

Je wil een oneven aantal om zo de kans om 50% er uit te halen en dat je duidelijk kan zeggen of het is gelukt of niet gelukt is. En Drie is dan een getal die niet heel veel meer extra tijd kost dan bijvoorbeeld 5.

Leg uit waarom er watercontroles zijn toegevoegd aan de qPCR-plaat.

Alles wat je toevoegt met water zonder je sample om aan te tonen dat het alleen je sample invloed heeft op de qPCR. Kijken of je schoon hebt gewerkt. Als hier fluorcentie in zit dan is het niet betrouwbaar.

Geef een verklaring voor de verschillende curves: wat zie je hier en wat betekent dit?

A: gaat stijl omhoog dus heeft veel start mRNA (cDNA)
B: gaat minder stijl omhoog dan B dus heeft minder start mRNA (cDNA)
D: er te weing mRNA (cDNA), niet goed gepipeteerd je mix (buffer ext.) of CDNA Kan ook je watercontrole zijn.
C: drempelwaarde; Ct-waarde= hoeveel cycli het kost om de drempelwaarde te halen

Leg uit waarom deze samples de waarde 'Not available' hebben.

Dat is je water controle en die wil je dat die onder de drempelwaarde blijft dus zijn er geen cycli die je kan tellen. Want het komt niet tot de drempelwaarde dus zijn geen gegevens niet aanwezig.

Wat doe je met een afwijkende Ct-waarde van een biologische replica?

Je kijkt na de andere twee in een biologische replica, kijken naar de actine daar ook hoger is die ook hoger dan is dan minder mRNA gepipetteerd en anders zit er ergens anders de fout.

Als te erg afwijkt kan je het weg strepen. Bij grijs gebeid laat je die staan en doe je de proef opnieuw. Ligt aan je significant cijfer.

Wat concludeer je op basis van de resultaten in deze dataset? Klopt dit met de verwachting die je eerder hebt genoteerd bij vraag 5? Leg uit waarom wel of waarom niet.

DNA schade zorgt voor toename van p21.
Mutatie van p53 en DNA schade zorgt dan p21 minder toe neemt, want p53 kan minder goed werken als een transcriptiefactor voor gen p21 kan binden.

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

genoom deel 2

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding

QPCR wercollege

14 belangrijke vragen over QPCR wercollege

Beschrijf aan de hand van het figuur hoe DNA-schade ertoe leidt dat de celcylus wordt geremd.

Voor welk van de genen p53, p21 en Mdm2 verandert te expressie na optreden van DNA-schade

Welke manier wordt in dit experiment gebruikt om DNA-schade te induceren in de cellijnen?

Je gaat uiteindelijk ook de mRNA-expressie bepalen in cellen waarin geen DNA-schade is aangebracht. Waarom is dat?

Hoe voer je een qPCR uit?

Hoe maak je van RNA cDNA?

Hoe kan je er achterkomen of je meet waardes juist zijn en wat zijn je controles?

Leg uit hoe met behulp van het mRNA-niveau van Actine hier onderscheid tussen gemaakt kan worden.

Waarom worden beide replica's minimaal drie keer in een qPCR-plaat meegenomen?

Leg uit waarom er watercontroles zijn toegevoegd aan de qPCR-plaat.

Geef een verklaring voor de verschillende curves: wat zie je hier en wat betekent dit?

Leg uit waarom deze samples de waarde 'Not available' hebben.

Wat doe je met een afwijkende Ct-waarde van een biologische replica?

Wat concludeer je op basis van de resultaten in deze dataset? Klopt dit met de verwachting die je eerder hebt genoteerd bij vraag 5? Leg uit waarom wel of waarom niet.

Samenvattingen die gerelateerd zijn aan Introductie - DNA- manipulatie technieken

genoom deel 2

Sobotta atlas of human anatomy : head, neck,…

eiwitten en moleculen

Organische Chemie

gedragsbiologie

Fysische chemie

Metabolisme

weefsel zelf

Statistiek

Weefsels

weefsels 2 zelf

oog voor impact