Total Internal Reflection (TIR) microscopie, superresolutie-fluorescentiemicroscopie en elektronenmicroscopie
3 belangrijke vragen over Total Internal Reflection (TIR) microscopie, superresolutie-fluorescentiemicroscopie en elektronenmicroscopie
Wat valt er te zeggen over Total Internal Reflection (TIRF) microscopy?
In conventionele microscopie zijn individuele fluorescent gelabelde moleculen niet te onderscheiden van hun achtergrond door emissie/scattering van licht van out-of-focus moleculen. Dit wordt opgelost door middel van TIRF:
Hiermee kan worden zichtbaar gemaakt: binding, diffusie, actieve voortbeweging (zowel in vitro als in vivo)
In de praktijk kunnen actinefilamenten bijvoorbeeld gebonden worden aan myosine-GFP
Zo kunnen individuele fluorescente moleculen in levende cellen gevolgd worden.
- Licht komt binnen onder een hoek, waardoor het grootste deel reflecteert, maar een klein deel een 'evanescent field' vormt
- Deze beperkt zich tot moleculen van 100-200 nm diepte
Hiermee kan worden zichtbaar gemaakt: binding, diffusie, actieve voortbeweging (zowel in vitro als in vivo)
In de praktijk kunnen actinefilamenten bijvoorbeeld gebonden worden aan myosine-GFP
Zo kunnen individuele fluorescente moleculen in levende cellen gevolgd worden.
Waarvan is diffusiegedrag van eiwitten afhankelijk? Wat zijn de verschillende vormen van diffusie?
- Effect van medium (cytoplasma met veel andere moleculen)
- (Zelf)associatie (andere moleculen of oligomerisatie)
- Interactie met DNA
- Specifieke lokalisatie in compartiment
- Zeefgedrag
Je hebt normale diffusie, subdiffusie (diffusie in beperkte ruimte, a<1), en directed motion (meestal actief transport, a>1)
Wat zijn de verschillende vormen van superresolutiemicroscopie, en wat is hun voornaamste doel?
- Structured Illumination Microscopy (SIM)
Dit levert een resolutie van 100nm (=0,5x de diffractielimiet), en kan gecombineerd worden met 'standaard' fluorescente labels.
- Stimulated Emission Depletion Microscopy (STED)
- Single-molecule localization based methods
Detectie van puntbronnen door fitten Gaussische intensiteitsverdeling (STORM). Hoe meer fotonen gedetecteerd worden (PALM), hoe meer de precisie toe zal nemen. In 3D gebeurt dit met een cylindrische lens.
Resolutie is 10-20nm (<0,1x), kan dus ook 3D en gebruikt wederom speciale fluorescente labels. Het kost wel tijd, en is dus minder geschikt voor het bestuderen van dynamische processen. - Photo activated Localization Microscopy (PALM)
- Stochastic Optical Reconstrucion Microscopy (STORM)
Deze worden gebruikt om objecten kleiner dan de diffractielimiet in kaart te brengen
De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:
- Een unieke studie- en oefentool
- Nooit meer iets twee keer studeren
- Haal de cijfers waar je op hoopt
- 100% zeker alles onthouden
Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.
