Basisprincipes van de PCR. 124 goede vragen, hier goed beantwoord

Is het voordeliger te digesteren met 1 of 2 restrictie-enzymen?

1, omdat inserts in 2 oriëntaties geligeerd kunnen worden. Maar er is wel kans op zelf-ligerende plasmides

Welke controles neem je mee bij ligatie?

1. plasmide digest - ligase => geen heel plasmide aanwezig
2. plasmide digestt + ligase => geknipt met 1 RE

Wat is het verschil tussen transformatie, transfectie en transductie?

transformatie: introductie van vreemd DNA in competente cellen
transfectie: eukaryoten met plasmide of siRNA (dit zorgt ervoor dat gen expressie omlaag reguleert!!)
transductie: bacteriën en eukaryote cellen met een virus

Hoe kun je cellen artificieel competent maken?

1. door een chemische behandeling van bacterien met CaCl2 gevolgd door een heatshock
2. door elektroporatie dmv een elektrische shock

Wat zorgt voor de blauw/witte kolonies bij blauw-wit screening en waarom is dit gebaseerd?

gebaseerd op de omzetting van lactose door B-galactosidase
WIT: als er een insert aan het lac Z gen zit, kan IPTG niet meer binden dus witte kolonies
BLAUW: als er geen insert aan het lacZ gen zit, bindt IPTG, wat zorgt voor blauwe kolonies

Waarom wil je bio-moleculen isoleren?

- onderzoek naar RNA: expressie genen, isoformen
- onderzoek naar eiwitten : expressie, functie, structuur of activiteit

Waarom is Nothern blot nadelig?

veel RNA nodig
radioactief
niet sensitief

Welke primers zijn er om cDNA te maken?

poly-dT primer: cDNA pool van alle mRNA moleculen via poly-A staart
random primers van 6 bp (hexameren): cDNA pool van alle RNA moleculen
specifieke primers: cDNA van 1 specifiek mRNA, microRNA of LncRNA

Hoe meet je PCR producten tijden qPCR?

Sybr.Green
Taqman probes ( DNA wat in de weg staat wordt opgegeten) (2 primers en 1 probe)
in een speciaal PCR apparaat met PCR reactie in een speciale plaat, zodat het signaal uitgelezen kan worden

Waardoor kan een referentiereeks bij PCR niet erg betrouwbaar zijn?

- minder cellen in experiment dan in het controle sample
- experimentele RNA sample had minder RNA om mee te beginnen
- cDNA reactie minder efficient in experimentele sample
- daarom altijd huishoudgenen meenemen!!

Wat is shotgun sequencing?

een methode om random stukken DNA te sequencen en daarna "in elkaar te puzzelen"

Welke manieren van homogeniseren bestaan er?

blenderen
mortieren
sonificeren
vriezen/ontdooien

Welke enzymatische lysis zijn er?

enzym lysozym (knipt peptidoglycanen in celwand)
protK (knipt eiwtten als je DNA/RNA wilt)
DNAse (knipt DNA als je RNA wilt)
RNAse (knipt RNA als je DNA wilt)

5 fasen van massa spectrometrie

Vaporatie
Ionisatie
Versnelling
Deflectie
Detectie

Tandem massa spectrometrie

isolatie eiwit
eiwit in stukjes knippen => peptides
peptiden scheiden
1e MS analyse (lage ionisatie)
2e MS analyse (hoge ionisatie)

Hoe vinden enzym en substraat elkaar in een cel?

1. cellulaire sublokalisatie: als enzym en substraat omgeven zijn door een membraan
2. protein scaffolds: groot complex waaraan meerder substraten en enzymen binden zodat ze elkaar makkelijker kunnen vinden

Hoe kunnen enzymen reacties katalyseren die energie kosten?

met ATP, GTP, FAD of NAD als co-enzym

Welke soorten enzymactiviteit remmers zijn er?

competitief: bindt op dezelfde plek ( active site) als het substraat
non-competitief: bindt op een andere plek dan het substraat; het enzym verandert van conformatie en kan het substraat niet meer omzetten ( wordt even onwerkzaam gemaakt)

Wat gebeurt er in de MM-vergelijking bij competitieve en non-competitieve remming?

competitief: Vmax blijft gelijk, maar daarvoor is wel meer substraat nodig. Km wordt hoger naarmate er meer of een sterkere remmer aanwezig is
non-competitief: Vmax wordt lager, Km blijft gelijk. Er is minder enzym beschikbaar voor omzetting, maar dit bindt even sterk aan het substraat

Welke soorten affiniteitschromatografie zijn er?

1. substraat analoog affiniteit chromatografie
2. immunoaffiniteit chromatografie ( niet specifiek)

Wat zijn de kenmerken van een cofactor?

anorganisch (ion) of organisch (co-enzym)
heeft zelf geen katalytische activiteit
verhoogd binding van enzym aan substraat
apoenzym + cofactor = haloenzym

Wat is het voordeel van Gateway cloning?

Er zijn geen restrictie enzymen of ligase voor nodig na incubatie

Welke elementen behoren ook tot de expressievectoren?

promotors, terminators en poly A signaal

Leg uit hoe blauw-wit screening werkt.

labvariant van E.Coli (DH5a) heeft een defect stuk B-galactosidase gen (lacZ)
een plasmide brengt het ontbrekende stuk in
IPTG zorgt voor inductie: er wordt B-galactosidase gemaakt
functioneel B-galac. zet de kleurstof Xgal om: blauwe kolonies
na klonering van insert, geen lacZ peptide: geen B-galac. dus geen Xgal omzetting: witte kolonies

Welke lading geeft SDS aan eiwitten?

Een negatieve lading, het is een anionisch detergens

Welke blast gebruik je om eiwit te vertalen naar nucleotiden?

tblastn

Betekent een hoge Kcat een snelle of trage omzetting?

een snelle omzetting, want Kcat is het aantal substraat moleculen dat per seconde per molecuul enzym wordt omgezet

Betekent een lage Km een goede of slechte binding tussen enzym en substraat?

Een goede binding

Wat is een coomassie kleuring?

Deze kleuring toont alle eiwitten aan. Altijd om de zuiverheid van het eiwit aan te tonen na SDS-PAGE

Waarom wordt er "ingezout" en "uitgezout" bij isolatie van eiwitten?

Inzouten: eiwitten hebben een beetje zout nodig om op te lossen
Uitzouten: eiwitten slaan neer bij een verhoging van zoutconcentratie

Wat bepaalt de affiniteit van een eiwit voor de kolom?

pH en ionsterkte. Hoe groter de afwijking pH van het IEP, hoe groter de affiniteit van het eiwit.

Wat is eiwit isolatie?

scheiding op grootte
scheiding op lading/ pI
scheiding op hydrofobiciteit ( oplosbaarheid)
eiwitmodificaties als glycoproteïnen en fosfaatgroepen

Wat zijn de 6 stappen van eiwit isolatie?

homogenisatie
precipitatie; matig scheidend vermogen; scheidt niet-eiwit componenten ( verkleint volume)
HIC; hoog scheideng vermogen ( verkleint volume)
ontzouten ( vergroot volume)
IEX; hoog scheidend vermogen (verkleint volume)
gelfiltratie; matig tot redelijk scheidend vermogen (vergroot volume)

Is immunoaffiniteits chromatografie specifiek?

Nee, omdat je niet perse interacties aangaat met een ander reagens tussen je eiwit dat je wilt zuiveren en het bolletjes materiaal

Hoe komt het dat eiwitten met dezelfde grootte met dezelfde snelheid door de gel runnen?

Hun oorspronkelijke vorm is volledig ontvouwt door SDS, dus hebben nu dezelfde vorm
Zij binden dezelfde hoeveelheid SDS en hebben daardoor dezelfde negatieve lading

Hoe wordt 2D-gel elektroforese uitgevoerd?

eiwitten worden gescheiden op lading ( + B-mercaptoethanol)
eiwitten worden gescheiden op pH gradiënt ( iso-elektrisch punt)

Is fenol/chloroform voor- of nadelig voor DNA-isolatie?

Het is giftig voor DNA-isolatie, maar het zorgt voor grote hoeveelheden DNA met hoge zuiverheid.
Bij RNA: water-verzadigde fenol (zuur, waardoor DNA oplost)
Bij DNA: buffer-verzadigde fenol

Waarom zijn silica-gebaseerde isolatiemethoden beter?

Ze zijn sneller en eenvoudiger. Silica is in waterige oplossingen negatief geladen, waardoor H2-atomen door de silica worden aangetrokken (mbv chaotrope zouten). Alleen de negatief geladen nucleïnezuren blijven plakken aan het silicamembraan

Hoe wordt mRNA geïsoleerd?

Aan een RNA-oplossing of cellysaat worden ijzerbolletjes met oligo (dT)-fragmenten toegevoeegd. Deze fragmenten zullen onder condities van een hoge zoutconcentratie hybridiseren aan de polyA-staarten van het mRNA. Vervolgens wordt de oplossing gewassen terwijl de ijzerbolletjes met een magneet in het reactievaatje worden gehouden. Het mRNA wordt geëlueerd in TE-buffer ( oplobaarheid + bescherming tegen degradatie).

Wat kan BSA en 0,5% Tween-20?

Deze kunnen de werking van SDS neutraliseren

Wat is Touchdown PCR?

Waarbij Ta hoger is dan Tm van de primers bij annealing.
Geen dimeren en aspecifieke producten.

Wat is Nested PCR?

PCR waarbij er gebruik wordt gemaakt van 2 primersets.
Zorgt voor hogere specificiteit en sensitiviteit.

Wat is essentieel voor de werking van Taq-polymerase?

Het werkt alleen in de aanwezigheid van Mg2+ als cofactor. Geen Mg2+, geen amplicifatie.

Wat gebeurt er met de PCR als er een overmaat aan template DNA wordt toegevoegd?

Dit remt de PCR, omdat Mg2+, dNTPs en Taq-polymerase aan het template binden zonder bij te dragen aan de amplificatie.

Hoe maak je onderscheid tussen polyA+-mRNA en overig RNA?

Met een oligo(dT) als primer; 12-18 bp lang, enkel uit thymidine nucleotiden die hybridiseren op polyA+-mRNA

Wat gebruik je bij een directe qPCR detectiemethode?

SYBR. Green

Wat gebruik je bij een indirecte qPCR detectiemethode?

probes gelabeld met een fluorochroom

Is een directe of indirecte qPCR detectiemethode specifieker?

Indirect, want er kan alleen signaal ontstaan als de probe kan binden aan het PCR-product

Wat onderscheid expressievectoren zich van kloneringsvectoren?

Zij hebben altijd een regulatoire promotor! En zijn daardoor vaak water groter en bevatten een tag voor affiniteitschromatografie

Wat zijn de nadelen van bacteriële expressie vectoren?

Je krijgt een eiwit van eigen gen en bacteriele genen
Eiwit is lastig te isoleren (bv door kristalvorming)
Glycolysering en vouwing van eukaryote eiwitten is niet goed; post-transcriptional modification

Waarom is de efficiëntie van transfectie afhankelijk van de celdeling?

na transfectie bevindt het plasmide zich in het cytoplasma
maar transcriptie vindt alleen plaats in de kern
bij celdeling lost het kernmembraan op
en pas na celdeling kan het recombinante gen tot expressie komen

Wanneer wordt massa spectrometrie toegepast?

Voor identificatie en kwantificatie van moleculen

Wat is het verwschil in opbouw tussen een Eiwit en DNA/RNA?

Eiwit is opgebouwd uit monomoren van aminozuren, terwijl DNA en RNA uit nucleotiden bestaan. Om eiwit, DNA en RNA in het lab te bestuderen moeten zij eerst vrijgemaakt worden uit cellen en eventueel uit kleinere membraanomgeven organellen, en vervolgens van elkaar gescheiden worden.

Wat zijn de 4 stappen bij het isoleren van bio-moleculen

Orgaan/weefsel/biopt homogeniseren

•Cellen lyseren(vaak genoeg voor eiwit lysaat)

•Scheiden van bestandsdelen dmv centrifugatie

•Isoleren van nucleïnezuren (RNA en DNA)

Wat is competentie? (bij transformatie en transfectie)

De mogelijkheid van cellen om DNA op te nemen;

- Natural: virale cellen nemen vrijwillig enpermeabel gunstig DNA op.

- Artificial: cellen worden permeabel gemaakt voor DNAmbv condities die in de natuur niet gebruikelijk zijn EN wordt zeer veelgebruikt om plasmides te introduceren in bacteriën

Welke 2 methoden gebruiken wij voor het competent maken van cellen?

1.Chemische behandelingvan bacteriënmet CaCl2gevolgddoor eenheat shock:

0 °C → 42°C

2. Electroporatie maakt bacteriën eneukaryote cellencompetent dmv een electrische schok

Wat houd blouw-wit screening in en waar is het op gebasseerd

•Gebaseerd op omzetting Lactosedoor β-Galactosidase

•Het LacZgen codeert voor cruciaal domein van β-Galactosidase

•In het LacZgen zit een polylinker: een Multiple Cloning Site

Welke 3 soorten type II restrictie enzymen zijn er

Isoschizomerenherkennen dezelfde sequentieVoorbeeld: SphI en BbuIherkennen CGTAC/G => beide sites kan je aan elkaar ligeren·

Neoschizomerenherkennen dezelfde sequentie, maar knippen andersVoorbeeld: SmaI CCC/GGG enXmaI C/CCGGG => beide sites kan je niet aan elkaar ligeren·

Isocaudomerenherkennen verschillende sequenties, maar geven dezelfde stikey-endsVoorbeeld: XhoI C/TCGAG enSalI G/TCGAC => beide sites kan je elkaar knippen

Wat zijn de voor en nadelen van werken met een plasmide?

- Plasmides zijn double-stranded-

Voordelen: - klein en makkelijk aantepassen naar wens.

- Nadelen: voor een bact kan het plasmidemakkelijk over genomen of aangepast worden.

Wat is molecular crowding?

de cel is geen vat vloeistof waarin af en toe een eiwit voorbij zwemt. Het is een compleet gevulde ruimte waar nauwelijks plaats is voor nieuwkomers. Deze drukte, ook wel molecular crowding, heeft gevolgen voor interacties tussen moleculen in de cel, en daar valt zeker ook de interactie tussen enzym en substraat onder. Er gelden in de cel andere regels voor het elkaar “vinden” van moleculen dan de algemene natuurkundige regels van de Brownse beweging.

De hoeveelheid cDNA kan je op 2 verschillende wijze meten in een RT-qPCR. Welke twee methoden?

Met SybrGreen dat kleurt al het PCR product. Of met probes die specifiek aan een target sequentie bindt en pas licht geeft nadat een polymerase langs is geweest. Het signaal van een probe is dus specifiek voor het gen dat je wilt meten.

Hoeveel basen kan je maximaal met 1 Sanger sequentie reactie aflezen?

≈300-1000bp. Wiki zegt >500bp

Wat betekent base call (in sequencing)

Base call is het vaststellen welke nucleotide wordt gesequenced.

Wat betekent read length (in sequencing)

Read lenght is de lengte van 1 aaneensluitende sequence die gesequenced kan worden.

Wat betekent coverage ( in sequencing)

Coverage is de hoeveelheid van unieke sequence reads die een specifiek base van het genoom uitlezen.

Wat is een cofactor? En wat is een co-enzym? Is er een verschil tussen de twee, zo ja wat?

Een cofactor is een chemische verbinding (geen eiwit), die nodig is voor biologische activiteit van een enzym, maar zelf geen enzymatische werking heeft.
Een co-enzym is een specifiek soort cofactor, namelijk een relatief klein organisch molecuul dat nodig is voor een enzym om zijn functie te vervullen. Metaal-ionen zijn een veelvoorkomend anorganische cofactor.
Denk bijv. aan de tweewaardige metaalionen Mg2+ en Ca2+ als cofactor voor DNAses en Zn2+ als cofactor voor metalloproteases

Hoe zou je de snelheid van een enzymatische reactie kunnen meten?

Door de afname van substraat en/of de toename van product over tijd te meten in aanwezigheid van enzym. Bij MBE meten we bijvoorbeeld de omzetting van L-DOPA naar dopachrome, in dit geval kunnen we de toename van het product kwantificeren met een spectrofotometer.

Wat zijn intrinsic disordered proteins?

Eiwitten die geen specifieke vorm aannemen maar meerdere vormen. Al naar gelang de omgeving veranderd

Wat doet neutralized phenol/chloroform/isoamyl alcohol? Waarom moet het geneutraliseerd zijn?

De mix van phenol/chloroform/isoamyl alcohol zorgt ervoor dat alle organische stoffen worden gescheiden van water - en het wateroplosbare DNA. Als de pH erg laag is, zal het DNA (negatief geladen) ook overgaan in de organische fase en houd je alleen het RNA over in de waterfase.

Als het goed is heb je gevonden dat je een ruime overmaat aan primers toevoegt t.o.v template DNA. Waarom is dat eigenlijk?

Elke nieuwe kopie van het template start met een primer, die al in de reactiemix aanwezig moet zijn. Het aantal kopieën neemt tijdens de reactie, als het goed is, logaritmisch toe. Het aantal aanwezige primers moeten geen belemmering vormen voor het vormen van nieuw PCR product als je de hoeveelheid startmateriaal wilt bepalen op basis van de hoeveelheid gevormd product.

Stel, je RT qPCR volgt een programma van 30 cycles. Hoeveel PCR-product hebben we dan na 30 cycli, uitgaand van een beginhoeveelheid van 105 viral copies /reactie?

Dit is in feite een zelfde berekening als voor de exponentiele groei van bacteriën in de log-fase. Alleen in het aantal generaties hier vervangen door het aantal cycli.
PCR product van 105 virusdeeltjes (template) na 30 cycles = 105*230 = 1*1014 moleculen PCR product.

Als je m.b.v. een PCR gaat sequencen, hoeveel primers heb je dan nodig? Motiveer of teken dit uit.

Eentje maar, je wilt het DNA niet repliceren maar alleen aflezen. Meerdere primers (bijv. een fwd en rev paar) geeft minimaal twee signalen door elkaar, dit vertroebelt de af te lezen sequentie. Je kunt wel 2 losse reacties inzetten met de fwd en rev primers, en dat gebeurt meestal ook . Je wilt dan minimaal zo’n lang stuk sequencen dat de goed leesbare stukken van de sequentie elkaar in het midden overlappen van je stuk DNA van interess

Waarin verschillen High throughput-Sequencing methodes tov Sanger sequencing?

Je analyseert vele verschillende DNA moleculen ipv van 1 DNA molecuul

Welke 3 handelingen komen overeen in de verschillende High troughput sequencing methoden?

Sample preparation
Sequencing
Data verwerking

Twee belangrijke “second generation” sequencing methoden zijn Ilumnia en Ion torrent sequencing. Wat is het verschil in detectie van de nucleotiden tussen deze twee methoden?

Ilumnia detecteert welke fluorescerende basen worden ingebouwd in de DNA synthese reactie in een cluster van DNA amplicons. Met de Ion torrent methode wordt een miniscule pH verandering gemeten wanneer een H+ vrijkomt bij het inbouwen van een base (de base worden apart aangeboden voor incorporatie). Het DNA zit vast aan een bead in een well

Waarin verschilt MinION methode tov Sanger, Ilumnia of Ion torrent sequencing?

Het gebruikt geen DNA amplificatie. 1 DNA strand wordt in z’n geheel door de Pore getrokken en geanalyseerd.

Onderzoeksvraag 1: In de Russische toendra wordt een bevroren pre-historische mensachtige gevonden. Het is mogelijk een nieuwe Neaderthaler soort. Om dit vast te stellen wil je het hele genoom sequencen

Ilumina, maar alles goed zolang ze maar een goede redenatie hebben

Onderzoeksvraag 2: Je gaat op date. Je hebt gelezen dat HLA genen een belangrijke onderbewuste rol spelen in het matchen tussen 2 partners. Om het datingsproces te versnellen wil je ter plaatse in de kroeg de HLA genen van je date sequencen om te onderzoeken of hij of zij bij je past

MinION, maar alles goed zolang ze maar een goede redenatie hebben

Onderzoeksvraag 3: In Noord-Oost Congo heerst mogelijk Ebola. Jij behoort tot een onderzoeksteam van the World Health Organisation en moet de uitbraak bevestigen. Je wilt bloed samples sequencen om de aanwezigheid van viraal genetisch materiaal te onderzoeken

MinION, maar alles goed zolang ze maar een goede redenatie hebben

Onderzoeksvraag 4: Je werk al tijden aan een ingewikkelde klonering. Uiteindelijk heb je eindelijk 1 kolonie op een plaat. Je isoleert DNA uit de minicultuur van deze kolonie en wil deze plasmide sequencen om te checken of het jouw gen van interessen ongemuteerd bevat

Sanger, maar alles goed zolang ze maar een goede redenatie hebben

Onderzoeksvraag 5: Je bent geïnteresseerd in alternatieve geneesmiddelen. Het is vaak onduidelijk waarom deze middelen werken. Daarom incubeer je een celkweek met een alternatief middel. Dmv sequencen wil je alle veranderingen van gen expressie in kaart brengen

Ilumina, maar alles goed zolang ze maar een goede redenatie hebben

Onderzoeksvraag 6: Voor de behandeling van een tumor is het van belang te onderzoeken wat de mutatie status is van het BRCA2 gen. Er wordt een biopt genomen uit de tumor om BRCA2 te sequencen.

Sanger

Waarvoor wordt de techniek eiwitchromatografie gebruikt?

Eiwitchromatografie is een methode om eiwitten te scheiden voor analyse of isolatie op basis van hun fysische eigenschappen, zoals bijvoorbeeld grootte, lading of hydrofobiciteit.

Wat is het nut van (online) databases in de moleculaire biologie?

Om de betekenis van bijvoorbeeld genomische informatie, cDNA of eiwitsequenties te kunnen interpreteren wil je deze kunnen vergelijken met bekende sequenties binnen een organisme, of tussen verschillende organismen. Je wilt misschien weten of een eiwit bekende domeinen bevat of wat de membraan-topologie hiervan zal zijn (=welke stukken van het eiwit binnen of buiten de celmembraan of de membraan van een celorganel zitten), bij welke ziekte een bepaalde mutatie betrokken is, etc. etc. Deze informatie kun je halen uit (online) databases. Door informatie te delen helpen wetenschappers elkaar en het onderzoek als geheel vooruit.

Na een aantal aanpassingen aan je materialen zie je nog steeds geen resultaat. Hoe kun je controleren of je PCR reactie om wat voor reden dan ook niet heeft gewerkt, OF dat het template (de sequentie die je wilt amplificeren) gewoonweg niet aanwezig is in de reactie?

Door een controlemonster mee te nemen waarbij het template zeker weten wel aanwezig is. Heb je die controle niet voorhanden, dan kun je een bestaand template met een ander primerpaar meenemen om te verifiëren dat alle ingrediënten in de mix, en ook het PCR apparaat, naar behoren functioneren.

De meeste restrictie enzymen zijn oorspronkelijk afkomstig uit bacteriën. In welke andere prokaryoten (in welk ander taxonomisch biologisch domein) zijn ook restrictie-enzymen gevonden? Wat voor functie hebben restrictie-enzymen in al deze organismen?

Restrictie-enzymen komen voor in Bacteria en Archaea, het andere domein van de prokaryote organismen. In deze organismen vormen de restrictie-enzymen een afweer tegen virussen, door viraal DNA af te breken. N.B. Virussen die bacteriën infecteren worden ook wel bacteriofagen, of kortweg ‘fagen’ genoemd. Het bacteriële genoom zelf wordt beschermd tegen de werking van de restrictie-enzymen door bijv. lokale methylatie, of gewoon door afwezigheid van de herkenningssequenties.

Het aantal nucleotiden in de restrictiesite is wel altijd een even getal. Kun je dit verklaren?

Bij een oneven aantal nucleotiden kan de sequentie nooit een palindroom zijn, waarbij na digestie twee (spiegel)identieke einden overblijven.

Waarom is dit enzym (DNA ligase) nodig voor het aan elkaar hechten van twee DNA strengen? Bij complementaire overhang zijn er toch ook al waterstofbruggen om de strengen bij elkaar te houden?

De suiker-fosfaat backbone moet weer aan elkaar gemaakt worden. Zoals bij WC/02 bij de activiteit van DNA polymerases werd uitgelegd, kost dit energie. DNA ligase gebruikt de energie van de afbraak van ATP moleculen naar ADP moleculen om deze binding (phosphodiester) tot stand te brengen.
Het is wel zo dat ‘sticky ends’ gemakkelijker aan elkaar geligeerd worden dan blunt ends, omdat ze elkaar binden door de waterstofbruggen en dus al in nauw contact zijn als het ligase zijn werk moet doen.

Welke componenten voeg je nog meer toe aan de ligatie-reactie, naast je vector en insert DNA?

DNA ligase natuurlijk, en een buffer met de juiste pH en ionen en ATP om het enzym optimaal zijn werk te kunnen laten doen. Je vult de reactie aan tot het gewenste totale volume met milliQ (heel zuiver water). Deze laatste stap is belangrijk om de componenten van de buffer op de juiste concentratie te brengen.
Heb je erg weinig DNA (meestal zal dat het insert zijn), dan is het gebruikelijk de reactie gewoon volledig aan te vullen met insert en te hopen dat het zo ook werkt

Zoek hiervoor informatie op over de termen supercoiled, nicked en relaxed DNA.

Een opgekrulde plasmide (supercoiled) zal minder weerstand ondervinden en sneller door de gel migreren dan een lineair stuk DNA van 6kb. Een plasmide waar 1 of meerdere enkelstrengs breuken in de dubbele DNA helix te vinden zijn (nicked of volledig relaxed), zal ‘ronder’ en ‘breder’ worden en meer weerstand ondervinden in de migratie door de gel. Deze zal dus hogerop te vinden zijn, bij een schijnbaar grotere lengte.

Stel dat je een transformatie doet, maar er groeit niets op je platen. Wat kan er dan allemaal misgegaan zijn? Er zijn meerdere antwoorden mogelijk!

Er kan van alles aan de hand zijn:
1. Een te lage starthoeveelheid competente cellen
2. Alle cellen zijn doodgegaan door de transformatie-behandeling
3. Te kort of niet op de goede temperatuur of vochtigheidsgraad geïncubeerd
4. De cellen waren niet competent en hebben de plasmide niet opgenomen
5. De transformatie-behandeling was niet succesvol
6. Het verkeerde of een te hoge concentratie antibioticum gebruikt
7. Geen circulaire plasmide gecreëerd met digestie en/of ligatie
8. Niet de goede antibiotica resistentie op de plasmide
9. Een te lage concentratie toegevoegd plasmide

Stel dat je weer een transformatie doet, maar nu zitten al je platen juist zitten propvol met bacteriekolonies. Kun je hiervoor een aantal redenen bedenken?

1. De bacteriën kunnen al tegen het antibioticum
2. Vergeten antibioticum toe te voegen
3. Te weinig antibioticum toegevoegd
4. Het antibioticum werkt niet (meer)
5. Heel veel contaminatie (…?)

Stel dat je wilt kijken naar de interactie van twee genproducten binnen een prokaryote cel. Je hebt beide producten gekloneerd in verschillende plasmides en deze vervolgens tegelijk getransformeerd in competente bacteriecellen.
Is het beter om hiervoor twee plasmides te gebruiken met een gelijke of verschillende antibiotica-resistentiegenen?

Verschillende antibiotica-resistentiegenen. Alleen dan kun je onder selectiedruk beide plasmides aanwezig hebben.

Stel dat de twee plasmides verschillende antibiotica-resistentie-genen bevatten. Moet je dan voor een succesvolle dubbele transformatie geen, een van beide, of beide antibiotica aan de kweek toevoegen?

Beide antibiotica moeten aanwezig zijn om onder selectiedruk beide plasmides aanwezig te hebben.

Welke kenmerken moet de gebruikte bacteriestam hebben om geschikt te zijn voor een blauw/wit screening? Is deze bacteriestam geschikt?

De bacteriestam moet een lacZ gen met N-terminale deletie hebben, het lacZΔM15 gen. Dat heeft deze bacteriestam. (Google maar eens op ‘XL1-blue’ en ‘lacZ’ of ‘lacZΔM15’)

Welke kenmerken moet het gebruikte plasmide hebben om geschikt te zijn voor een blauw/wit screening? Is dit plasmide geschikt?

De plasmide moet het lacZΔM15 complementerende lacZa gen bevatten, met daarin de MCS. Dat heeft deze plasmide. (Google maar eens op pUC19 dan vind je als eerste hit de plasmid map van Addgene)

Welke stoffen moet je allemaal toevoegen aan je LB-Agarplaat na transformatie om blauw/wit screening te kunnen uitvoeren om te controleren op clones die je plasmide met insert hebben opgenomen?

Ampicilline, om te selecteren voor de clones die een plasmide hebben opgenomen (met ampicilline-resistentie-gen). IPTG, om het product van het lacZΔM15 gen af te schrijven in de bacterie en X-gal om de bacteriën die een plasmide zonder insert hebben opgenomen blauw te laten kleuren.

Waarom starten de primers aan het 5’ einde niet meteen met de herkenningssequenties van de gebruikte restrictie-endonucleases?

Restrictie-endonucleases zijn enzymen die niet aan de uiteinden van het DNA nucleotiden afsplitsen (dat zijn exonucleases) maar binnenin een sequentie. Ze hebben aan beide zijden naast hun herkenningssequentie ook ‘houvast’ nodig. Daarom worden in een primer om restrictiesites te introduceren meestal 2 of 3 extra nucleotiden aan de 5’ kant toegevoegd. Welke nucleotiden dit zijn doet er niet toe, ze worden bij digestie voor de klonering toch verwijderd. Meestal wordt gekozen voor G’s of C’s, deze binden sterker aan hun template (in de 2e cycle en verder) dan A’s of T’s

Stel dat je het gen dat codeert voor het eiwit oryzacystatin in een plasmide wilt kloneren en er een fusie-eiwit van wilt maken met een ander (marker)eiwit. Waar moet je dan op letten wat betreft de doorlopende sequentie?

Dat hetzelfde reading frame doorleest in de start van de ‘tag’ en dat je de STOP uit de coderende sequentie van je gen van interesse haalt.

Soms wordt deze stap nog voorafgegaan aan het opnemen en afdraaien van de cellen in ‘PBS’. Waarvoor staat deze afkorting, en waarom wordt deze stap in het protocol opgenomen

PBS = phosphate-buffered saline, ofwel fosfaat-gebufferd (op pH) fysiologisch zout. Dit is een vloeistof waarin je cellen niet lyseren (het zorgt voor dezelfde omstandigheden als in het lichaam). In deze procedures wordt het gebruikt om je cellen te wassen, zodat alle contaminatie in het medium, van mediumcomponenten en mogelijk ook van DNAses, RNAses en proteases, niet stoort bij de isolatie.

Wat is eiwit denaturatie? Op welke manieren kunnen eiwitten worden gedenatureerd?

Eiwitten worden compleet ontvouwen (verliezen hun quaternaire, tertiaire en secundaire structuur) en hechten daarna met hun verschillende functionele groepen aan functionele groepen van andere ontvouwen eiwitten. De eiwitten aggregeren hierdoor en slaan neer. Denaturatie kan het gevolg zijn van verhitting, blootstelling aan een lage of juist erg hoge pH, een geconcentreerde zoutoplossing, een organisch oplosmiddel of verschillende soorten straling

Geef een voorbeeld van een analysemethode waarbij het essentieel is dat gezuiverd eiwit (gedeeltelijk) gedenatureerd is.

De ruimtelijke vorm en functie van een eiwit worden bepaald door de primaire structuur (aminozuurvolgorde), secundaire structuur (alpha-helices en beta-sheets), tertiare structuur (totale driedimensionale vorm) en eventuele quaternaire structuur (binding in een multi-subunit eiwitcomplex met andere eiwitten). Bij een SDS-PAGE moeten de bindingen tussen de onderdelen van een multi-subunit complex worden verbroken om de individuele componenten te kunnen scheiden en visualiseren. Als je een eiwit wilt binden/aantonen met een antilichaam wat gericht is tegen de primaire structuur, moet dit peptide in gedenatureerde staat aanwezig zijn.

Geef een voorbeeld van een onderzoeksmethode waarbij het essentieel is dat gezuiverd eiwit functioneel blijft. Hoe voorkom je denaturatie?

Als je bijv. de interactie van een eiwit met andere eiwitten wilt onderzoeken, of de functie van een enzym wilt meten is het belangrijk dat de natieve vorm van het eiwit behouden blijft. Dit kun je doen door tijdens de isolatieprocedure de pH en zoutconcentratie in het fysiologische bereik te houden

Hoe heten enzymen die eiwitten degraderen? Waar komen deze enzymen van nature voor? Hoe kun je deze enzymen tijdelijk of blijvend onschadelijk maken?

Eiwitten zijn gemiddeld stabieler dan RNA, maar instabieler dan DNA. Cellen bevatten proteases (enzymen die eiwitten afbreken) dus je eiwitsample sowieso ook! De groep van metalloproteases (cofactor Zn2+) kunnen worden geremd met protease-inhibitors. Als je juist de activiteit van bepaalde metalloproteases wilt meten moet je deze natuurlijk niet inhiberen; je moet dan extra voorzichtig te werk gaan en je eiwitten koud verwerken (in de koude kamer op 4°C; ofwel op ijs) en bewaren (bij -20°C).

Wat gebeurt er als je te veel dNTPs toevoegt bij PCR?

Grotere kans dat dNA-polymerase de verkeerde dNTP inbouwt

Wat gebeurt er als je te weinig dNTPs toevoegt bij PCR?

Synthesesnelheid van polymerase verminderd, PCR-efficientie neemt af

Wat is relatief kwantificeren?

Met behulp van een referentie-gen de kwaliteit van een sample vaststellen

Hoe werkt de regulatie van het lacZ gen?

Een lac repressor eiwit bindt aan de proomotor van het lacZ gen, en voorkomt hiermee de transcriptie van dit gen. Alleen als lactose bindt aan de lac repressor zal deze loslaten van het DNA en wordt transcriptie mogelijk.

Wat is het lac operon?

Andere genen ( naast lacZ) die achter dezelfde prokaryote promotor liggen en allemaal gereguleerd door lactose.

Wat gebeurt er als er een insert wordt toegevoegd bij blauw/wit screening?

Het MCS blijft niet intact, dus ook lacZa niet. Hierdoor worden de eiwitten van lacZaM15 niet aangevuld en zal er dus geen functioneel B-gal worden gevormd en kan X-gal niet worden omgezet in een blauwgekleurd product.

= WITTE KOLONIES

Waar dient KCl voor in de Taq buffer?

Primerbinding

Waar zorgt MgCl2 voor in de Taq buffer?

Enzym activiteit

Welke invloed hebben Mg-ionen op de PCR?

> Te laag
- onvoldoende cofactor

> Te hoog
- Tm stijgt
- specificiteit annealing daalt
- afname enzymactiviteit

Welk fragment heeft proofreading en wordt veel gebruikt in de moleculaire biologie?

Klenow fragment

Wat doen ureum en Guanidine-HCl?

Denatureren eiwitten volledig, omdat ze sterke interactied met H2O aangaan/ verdrijving van water. Polaire groepen kunnen dus niet met H2O reageren => eiwit wordt binnenste buiten gekeerd.

Waar dienen buffers P1, P2 en N3 voor?

Buffer P1: bacterien in de juiste startbuffer
Buffer P2: lyseert bacterien
Buffer N3: denatureert eiwitten; scheiden plasmide DNA van eiwitten

Waarbij kun je de Pfaffle rekenmethode toepassen?

Bij PCR;

- Bij de Pfaffle neem je altijd een referentie verdunningsreeks mee
- Daarom bereken je elke PCR opnieuw de PCR efficiency (E)

ratio = ((Etarget) x deltaCTtarget) / ((Eref) x deltaCTref)

Nadeel: minder ruimte op PCR plaat wegen referentie verdunningsreeksen

Wat is de volgorde van Edman degradatie?

Knippen van de aminozuurketen
Chemische verandering van het eindstandig aminozuur met fenyl
Losmaken van dit aminozuur (rest blijft intact!)
Bepaling identiteit aminozuur
Volgend aminozuur: identificatie van het gehele eiwit (max. 50 aminozuren)
Nu: sequencing DNA, eiwit sequentie is minder belangrijk
Vervolgens massa spectrometrie op eiwitten en peptiden

Wat is het verschil tussen dialyse en ultrafiltratie?

Dialyse is voor het selectief moleculen verwijderen uit je oplossing.
Ultrafiltratie concentreert het eiwit.

=> Voor verwijdering van zout of kleine organische moleculen

Waarop is Illumina gebaseerd?

Het is gebaseerd op reversibele kleur-terminators die de identificatie van enkele basen mogelijk maken wanneer ze in DNA-strengen worden geïntroduceerd.

Hoe werkt ion torrent?

Het is gebaseerd op waterstofionen die vrijkomen tijden de DNA polymerisatie

Wanneer gebruik je whole genome sequencing?

Bij het bepalen van al het chromosomale DNA van het organisme

Wat doet DMSO bij PCR?

DMSO, formamide of glycerol verbetert processiviteit van (Taq-) DNA polymerase door de H-bruggen van DNA te destabiliseren. Hierdoor kan het enzym dsDNA ontwinden.

Wanneer je een oplossing centrifugeert, welke fasen met welke componenten krijg je dan na centrifugatie?

Onderaan: organische fase; bevat organische oplosmiddelen
Midden: interfase; vetten gemengd met eiwitten
Bovenaan: waterfase; nucleinezuren (DNA/RNA) met koolhydraten

Dus bij DNA/RNA isolatie neem je allen de waterfase mee

Basisprincipes van de PCR

124 belangrijke vragen over Basisprincipes van de PCR