Startpagina / Samenvattingen / Moleculaire biologie / gel-dna-migratie

Elektroforese van DNA-fragmenten - Agarosegelelektroforese

18 belangrijke vragen over Elektroforese van DNA-fragmenten - Agarosegelelektroforese

Wat gebeurt er als voorbereiding voor de elektroforese?

In de elektroforesekamer wordt agarose met een geschikte concentratie gegoten. Aan de kant van de kathode wordt er een kam aangebracht in de vloeibare agarose, die dan verwijderd wordt na het hard worden van de gel (door af te koelen). Hierdoor zijn er wells gevormd in de gel, waarin we de DNA-stalen kunnen laden. De gestolde agarosegel wordt ondergedompeld in elektroforesebuffer.

Waarom wordt de elektroforesetank afgedekt met een deksel?

Om verdamping te voorkomen

Voor wat zorgt het elektrisch veld dat aangelegd wordt?

Het elektrisch veld dat over de gel aangelegd wordt, doet de negatief geladen DNA-fragmenten (omwille van de fosfaatgroepen) vanuit hun startplaats (kathode) bewegen naar de positieve elektrode (anode) doorheen de gelmatrix.

Wat zijn de eerste tekenen dat er stroom door het systeem vloeit?

Het ontstaan van waterstofgas aan de negatieve elektrode en zuurstofgas aan de positieve elektrode (afkomstig van de elektrolyse van water)

Hoe kan de vooruitgang in de gel gevolgd worden?

Kort erna zijn er twee gekleurde bandjes per laan in de gel zichtbaar, die naar de positieve pool bewegen. De laadbuffer bevat immers kleurstoffen om de vooruitgang in de gel te kunnen volgen. Het DNA zelf is niet zichtbaar en zou van de gel lopen indien de stroom niet op tijd afgelegd wordt.

Door wat kan bromofenolblauw migreren?

Bromofenolblauw migreert door een 0.8 % gel met dezelfde snelheid als een DNA-fragment van ongeveer 300 basenparen lang.

Hoe snel migreert xyleencyanol door de gel?

Xyleencyanol migreert aan een snelheid die equivalent is aan ongeveer 9000 basenparen. De beste scheiding bij de analyse van faag  en plasmide DNA bijvoorbeeld, wordt bereikt wanneer bromofenolblauw 40 à 70 mm heeft afgelegd.

Hoe kunnen DNA-fragmenten van elkaar gescheiden worden?

De gelmatrix is te vergelijken met een zeef, kleinere DNA-fragmenten bewegen vlugger door de poriën in vergelijking met de grotere fragmenten. Zo kunnen restrictiefragmenten van verschillende grootten gescheiden worden in afzonderlijke bandjes tijdens de elektroforese (Figuur 6-1). Het karakteristieke patroon van de bandjes kan zichtbaar gemaakt worden met een kleurstof die aan de DNA-moleculen bindt.

Hoe kan het DNA geïdentificeerd worden?

Na elektroforese kan het DNA geïdentificeerd worden aan de hand van merkers die een gekend moleculair gewicht hebben. Na aflezen van hun relatieve posities op de gel, kan een ijkcurve worden opgesteld die de logaritme van het moleculair gewicht weergeeft in functie van de gemigreerde afstand. Van het onbekende DNA-fragment wordt vervolgens het moleculair gewicht bepaald uitgaande van deze calibratiecurve en de afgelegd afstand doorheen de gelmatrix.

Door welke vier factoren wordt de snelheid van de migratie in de gel bepaald?

Het moleculair gewicht van het DNA, de agaroseconcentratie, de conformatie van het DNA en de aangelegde spanning.

Welke invloed heeft het moleculair gewicht op de snelheid van de migratie?

Lineaire dubbelstrengige DNA-moleculen lopen doorheen de gelmatrix aan snelheden die omgekeerd evenredig zijn met log10 van hun moleculaire gewichten.

Welke invloed heeft de agaroseconcentratie op de snelheid van de migratie?

Een DNA-fragment met een bepaalde afmeting beweegt met verschillende migratiesnelheden doorheen gels met een verschillende agaroseconcentratie, aangezien er gels met verschillende poriëngrootten ontstaan. De agaroseconcentratie regelt de grootte van de moleculen die door de gel kunnen bewegen. Hoe geconcentreerder de gel is, hoe groter de beperking voor grote moleculen.

Welke invloed heeft de conformatie van het DNA op de snelheid van de migratie?

Circulair en lineair DNA met hetzelfde moleculair gewicht bewegen met verschillende snelheden door de gel. De circulaire vorm beweegt het traagst.
Supercoiled DNA heeft een compactere conformatie in vergelijking met zijn 'relaxte' equivalent. Het zeer sterk opgewonden DNA beweegt dus vlugger dan 'relaxed' DNA tijdens gelelektroforese.
Enkelstrengig DNA beweegt op zijn beurt sneller dan dubbelstrengig DNA, omdat enkelstrengig DNA zich gemakkelijker kan plooien en kan zich beter wringen tussen de partikels.

Welke invloed heeft de aangelegde spanning op de snelheid van de migratie?

De migratie van DNA doorheen een agarosegel hangt eveneens af van de spanning. Hoe hoger de aangelegde spanning, hoe sneller de migratie.

Voor welke problemen zorgen hogere voltages?

Hogere voltages accentueren echter onvolmaaktheden in de gel, zoals verschillen in dichtheid en dikte. Zo’n effecten zorgen voor U-vormige bandjes ('smiles'). Effecten waarbij de bandjes schuin lopen, komen typisch voor aan de randen van de gel. Warmte die ontstaat tengevolge van de hoge voltages kan de gel doen smelten, waardoor de zeefeigenschappen wijzigen. Omwille van deze redenen moet een spanning van meer dan 125 Volt vermeden worden. Als norm wordt 5 V/cm genomen.

Wat is sikkelcelanemie en hoe kan het opgespoord worden?

Bij sikkelcelanemie is er een abnormaal gevormd hemoglobine. De puntmutatie hier is dat de T een A wordt in DNA. Daardoor wordt de A een U in het mRNA. Met gevolg dat GAG ==> GUG wordt en dat we valine krijgen in plaats van glutamine. Bij sikkelcelanemie is er een verlies van 1 knipplaats voor het restrictie-enzym waardoor er verschillende migratie patronen verkregen worden bij gel-elektroforese.

Hoe kan gelelektroforese bijdragen dat DNA-fingerprinting?

Verschillende individuen hebben verschillende bandenpatronen ==> de bandenpatronen kunnen vergeleken worden voor personen-identificatie, zo kunnen misdaden opgelost worden.

Hoe kan gelelektroforese bijdragen tot verwantschapsonderzoek?

Familieleden hebben een gelijkaardig bandenpatroon ==> de bandenpatronen kunnen vergeleken worden om verwantschappen aan te tonen (zo werkt de vaderschapstest)

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

Moleculaire biologie

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding

Elektroforese van DNA-fragmenten - Agarosegelelektroforese

18 belangrijke vragen over Elektroforese van DNA-fragmenten - Agarosegelelektroforese

Wat gebeurt er als voorbereiding voor de elektroforese?

Waarom wordt de elektroforesetank afgedekt met een deksel?

Voor wat zorgt het elektrisch veld dat aangelegd wordt?

Wat zijn de eerste tekenen dat er stroom door het systeem vloeit?

Hoe kan de vooruitgang in de gel gevolgd worden?

Door wat kan bromofenolblauw migreren?

Hoe snel migreert xyleencyanol door de gel?

Hoe kunnen DNA-fragmenten van elkaar gescheiden worden?

Hoe kan het DNA geïdentificeerd worden?

Door welke vier factoren wordt de snelheid van de migratie in de gel bepaald?

Welke invloed heeft het moleculair gewicht op de snelheid van de migratie?

Welke invloed heeft de agaroseconcentratie op de snelheid van de migratie?

Welke invloed heeft de conformatie van het DNA op de snelheid van de migratie?

Welke invloed heeft de aangelegde spanning op de snelheid van de migratie?

Voor welke problemen zorgen hogere voltages?

Wat is sikkelcelanemie en hoe kan het opgespoord worden?

Hoe kan gelelektroforese bijdragen dat DNA-fingerprinting?

Hoe kan gelelektroforese bijdragen tot verwantschapsonderzoek?

Samenvattingen die gerelateerd zijn aan De nucleïnezuren DNA en RNA - DNA - De DNA-replicatie

Moleculaire biologie

Moleculaire biologie Kimberley

Immunologie

Immunologie Kimberley

Class notes - Immunologie

Class notes - Advanced labtools

Exploring humans an introduction to the phil…

Psychologie & sociologie : basiscursus

sheets

Leren veranderen

Overheidsfinanciën

Hoofdzaken socialezekerheidsrecht