Startpagina / Samenvattingen / Class notes - Moleculaire Eukaryote Microbiologie / equivalent-yep-yip

Genetica en moleculaire technieken

Q: Wanneer gebruik je een YIp equivalent?

Deze vectoren gebruik je voor hoge productie door te selecteren op hoog copynummer in het genoom en bestuderen promotoren binnen context chromosoom.

13 belangrijke vragen over Genetica en moleculaire technieken

Kan een plasmide repliceren in een filamenteuze schimmel? (dus geen bakkersgist)

Autonoom replicerende plasmiden komen in de natuur alleen voor bij gisten zoals S. cerevisiae. Indien een plasmide wordt voorzien van een replicatiesequentie uit één van de chromosomen van een filamenteuze schimmel dan zal dit plasmide zich in de regel niet autonoom gaan repliceren in deze schimmel.

Wat is de oplossing om een plasmide wel te kunnen laten repliceren in een filamenteuze schimmel?

Het gebruik van een YIp of een YEp equivalent.

Wat is een YIp equivalent?

Het merendeel van de vectoren voor filamenteuze schimmels zijn YIp equivalenten.Plasmide E.coli + selectiemarker schimmel.

Is stabiel bij afwezigheid van selectiedruk.
Transformatie sequentie is erg laag
Copy nummer niet direct bekend en expressie ook afhankelijk van plaats van integratie
ectopische integratie

Wat is het verschil tussen homologe integratie en ectopische integratie?

Homologe integratie = het integreren op de plek waar hij een stuk homoloog DNA tegenkomt (bij bakkersgist).
Ectopische integratie = gaat willekeurig ergens zitten in het chromosoom.

Wat is een YEp equivalent?

Plasmide E.coli + selectiemarker schimmel + AMA sequentie

Niet stabiel bij afwezigheid van selectiedruk: daarom AMA sequentie.
Hoog copy nummer
Voordeel: eenvoudig mutanten complementeren (net als bij gist) en eenvoudig complementerend DNA isoleren. Ook kan men promotor studies doen buiten de context van het chromosoom.
Gunstig om iets tijdelijk tot expressie te brengen.

Wat is een AMA sequentie en waarom wordt de AMA sequentie gebruikt bij een YEp equivalent?

AMA sequentie is een antibioticum resistentie. Als deze AMA sequentie op de vector zit dan kan deze blijven repliceren. Je kunt de selectiedruk handhaven door altijd antibioticum in het medium toe te voegen, waardoor alle cellen met een AMA sequentie kunnen groeien.

Wanneer gebruik je een YIp equivalent?

Deze vectoren gebruik je voor hoge productie door te selecteren op hoog copynummer in het genoom en bestuderen promotoren binnen context chromosoom.

Wanneer gebruik je een YEp equivalent?

Bestuderen promotoren buiten context chromosoom en complementatie van mutanten.

Je wilt weten wat verantwoordelijk is voor een mutant in lysine. Kun je daarvoor beter een YEp of YIp equivalent gebruiken? Leg ook uit hoe dit in zijn werk gaat.

Je kunt het beste een YEp equivalent gebruiken.

DNA isoleren van WT
DNA willekeurig fragmenteren
Stukjes gefragmenteerd DNA in YEp equivalent (plasmide) zetten
Plasmide inbrengen in mutant
Kijken welke stukje weer is gerestored
Op een medium zonder lysine zal weinig groei zijn, want de meeste krijgen een willekeurig ander stukje
Degene die kan groeien op medium zonder lysine is de gecomplementeerde mutant
Plasmide isoleren en opsturen

Je wilt weten wat verantwoordelijk is voor een mutatie in lysine, maar hebt geen YEp equivalent ter beschikking. Leg uit hoe je te werk gaat.

Als je geen YEp equivalent kunt gebruiken dan gebruik je een YIp equivalent. Het terugvinden van het gecomplementeerde stuk is dan wel lastiger.

WT DNA isoleren en fragmenteren
WT DNA kloneren in YIp equivalent
Plasmide inbrengen in mutant en kijken welke mutant weer is gerestored
Bij YIp equivalent krijg je er nog minder die groeien dan bij YEp, omdat YIp transformaties minder efficiënt zijn.
DNA van gecomplementeerde mutant isoleren
PCR met primers voor weerszijden van de MCS waar het gekloneerd is
Fragment kloneren in plasmide, amplificeren en opsturen

Een onderzoeker heeft een YEp equivalent gebruikt en veel getransformeerd, maar vindt geen complementatie op een plaat zonder lysine. Wat raadt de begeleider aan?

Gebruik maken van een andere restrictie. De site die je gebruikt kan midden in het gen zitten waardoor het gen nooit in het geheel in de mutant wordt ingebracht, waardoor je dus geen complementatie krijgt.

Welke 2 mogelijkheden zijn er om niet- en wel getransformeerde cellen van elkaar te onderscheiden? Leg uit hoe deze werken

Gebruik van auxotrofe mutanten: je gebruikt een mutant die een bepaalde stof niet kan maken (bijv. uracil), vervolgens transformeren met een WT-copy van het gen. Transformanten kunnen dan in tegenstelling tot niet-getransformeerde cellen groeien op een minimaal medium zonder uracil.
Antibioticum resistentie: men kan gebruik maken van een gen dat resistentie geeft voor een antibioticum waarvoor de schimmel gevoelig is, zoals hygromycine. Het hygromycine fosfotransferase gen (HPT) uit E.coli wordt gekloneerd tussen 5' en 3' expressiesequenties die door de schimmel wordt herkend. Hierbij moet ook gebruik worden gemaakt van een constitutieve promotor.

Welke 2 methodes zijn er om schimmels te transformeren?

Protoplast transformatie
Agrobacterium systeem

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

Moleculaire Eukaryote Microbiologie

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding

Genetica en moleculaire technieken

13 belangrijke vragen over Genetica en moleculaire technieken

Kan een plasmide repliceren in een filamenteuze schimmel? (dus geen bakkersgist)

Wat is de oplossing om een plasmide wel te kunnen laten repliceren in een filamenteuze schimmel?

Wat is een YIp equivalent?

Wat is het verschil tussen homologe integratie en ectopische integratie?

Wat is een YEp equivalent?

Wat is een AMA sequentie en waarom wordt de AMA sequentie gebruikt bij een YEp equivalent?

Wanneer gebruik je een YIp equivalent?

Wanneer gebruik je een YEp equivalent?

Je wilt weten wat verantwoordelijk is voor een mutant in lysine. Kun je daarvoor beter een YEp of YIp equivalent gebruiken? Leg ook uit hoe dit in zijn werk gaat.

Je wilt weten wat verantwoordelijk is voor een mutatie in lysine, maar hebt geen YEp equivalent ter beschikking. Leg uit hoe je te werk gaat.

Een onderzoeker heeft een YEp equivalent gebruikt en veel getransformeerd, maar vindt geen complementatie op een plaat zonder lysine. Wat raadt de begeleider aan?

Welke 2 mogelijkheden zijn er om niet- en wel getransformeerde cellen van elkaar te onderscheiden? Leg uit hoe deze werken

Welke 2 methodes zijn er om schimmels te transformeren?

Samenvattingen die gerelateerd zijn aan Introductie tot de schimmels

Class notes - Moleculaire Eukaryote Microbio…

Psychologie & sociologie : basiscursus

sheets

Leren veranderen

Overheidsfinanciën

Hoofdzaken socialezekerheidsrecht

Handboek van het Nederlandse staatsrecht

Van de BV en de NV

Socialezekerheidsrecht

Schets van het Nederlandse arbeidsrecht

Internationaal publiekrecht in vogelvlucht

Ondernemings- en faillissementsrecht