NGS/exome sequencing
24 belangrijke vragen over NGS/exome sequencing
Geef de 4 stappen van klassieke Sanger sequencing.
- fragmenteren van DNA (shotgun)
- amplificeren DNA (dit vooral kostte heel veel tijd, klonering)
- extension en chain termination
- electrophoresis
Wat is de doorbraak die leidde tot ontwikkeling van NGS ( = high troughput sequencing)?
Eerste machine = 454 Life sciences sequencer, dus op basis van pyrosequencing.
Hoe wordt een DNA library gemaakt?
Illumina: gevolgd door cluster amplificatie.
- Hogere cijfers + sneller leren
- Niets twee keer studeren
- 100% zeker alles onthouden
Voor mijn 1e tentamen haalde ik een 6. Toen ben ik gaan zoeken naar manieren om beter te leren en ben ik Study Smart tegen gekomen. Sindsdien heb ik een 9,0 - 8,0 - 7,6 - 8,0 - 8,0 gehaald. Ik raad het echt íédereen aan die het maar horen wil. Ik ben er zo blij mee!!
Met mijn oude methode was ik geslaagd voor maar 3 van de 8 vakken. Sinds ik mijn aantekeningen digitaal maak in study smart, ben ik voor alle vakken de éérste keer geslaagd. StudySmart neemt voor mij de stress van slagen of niet slagen weg.
Door StudySmart gaat het op zo veel vlakken beter met mij. Eerst had ik continu studiestress en ik had nergens tijd voor. Nu voel ik mij rustig en zelfverzekerd (door gebruik van het programma). Eerst haalde ik meestal een 7, nu vaak een 8 of zelfs een 9.
Hey Chris, ik wil je echt hartelijk danken voor het ontwikkelen van het platform. Ik haalde hiervoor altijd rond de 6/10 voor m'n tentamens, nu een 8,6, een 7,9 en een 7,6!!
Sinds ik Study Smart gebruik, is mijn gemiddelde 1 punt gestegen. Ik heb zelfs een statistisch vak met een 10/10 afgerond terwijl ik slecht ben in statistiek. Nu volg ik extra vakken omdat vorig jaar zo goed ging door Study Smart. Veel dank!
Sinds ik ben gaan leren met StudySmart ben ik geslaagd voor al mijn examens!!! Geen herexamens!! Eerst was ik al blij met een voldoende en nu haal ik alleen maar goede cijfers. Veel dank!
Ik heb alle vakken die ik met Study Smart heb geleerd gehaald. Met rechten ben ik van een 5 naar een 8 gegaan! Ik weet nu zeker dat ik al mijn vakken gewoon ga halen.
Ik dacht altijd dat ik goed studeerde. Mijn cijfers waren ook prima. Ik had mij nooit kunnen voorstellen dat ik zo veel beter en sneller zou studeren door het toepassen van deze vaardigheden.
Ik voel mij voor het eerst 100% zeker over de manier waarop ik leer. Ik heb nu het complete overzicht en de structuur die ik nodig had
Door Study Smart kreeg ik weer plezier in het studeren en haalde ik direct betere cijfers. Alles ging ineens beter. Ik raad Study Smart enorm aan aan scholieren en studenten.
Met dit plaform kan ik super snel en gestructueerd studeren. Ik ben nooit meer de weg kwijt in de stof of in mijn aantekeningen en maak veel sneller goede samenvattingen.
Eerst waren mijn aantekeningen een zooitje. Nu gebruik ik Study Smart en studeer ik super gestructureerd. Het helpt mij om tijd te besparen waardoor ik ook andere dingen kan doen die ik belangrijk vind.
Leerlingen die met het systeem hebben gewerkt hebben gewoon een beter resultaat behaald. Het systeem past alle leertrucjes zo toe, dat zowel de kinderen die goed scoren, maar ook zij die minder scoren, aan hun trekken komen.
Hey Chris, ik wil je enorm bedanken. Het vak waar ik vorig jaar nog net een 5,5 voor haalde, heb ik nu voor ditzelfde vak maar liefst een 9,7 gehaald! Mede dankzij jouw methode! Heel erg bedankt!
Het grootste effect is dat mijn kind veel enthousiaster is over school! Elke ouder wilt graag dat zijn kind het goed doet op school, en Study Smart draagt daar aan bij.
Dankzij StudySmart heb ik vorig jaar al mn examens gehaald en ook veel betere punten gehaald. Maar bovenal heb ik nu gewoon een heel goede studiemethode onder de knie, waarmee ik zeker weet dat ik de rest van mijn studie gewoon ga halen.
Wat is het doel van sequence alignment?
Daartoe: alignen van sequences met een reference genome om identiteit te bepalen.
BLAST/BWA gebruiken: deze leggen de reads op de juiste positie op de referentie sequentie.
Wat houdt de term coverage in? Waarom is deze term relevant?
- Per nucleotide-positie tellen hoeveel reads overlappend zijn. Dan krijg je dus bijv een coverage van 4, als 4 reads dit nucleotide beslaan.
- kijken hoeveel procent van de referentie sequentie is afgedekt met reads --> percentage.
De coverage zegt iets over de kwaliteit van de analyse.
Mate Pairs/Paired-end sequencing zijn veelgebruikte technieken. Leg uit wat ze inhouden.
- Paired end: fragmentation of genomic DNA into short segments, followed by sequencing of both ends of the segment.
- Mate Pairs: gDNA: circulair, ook aan twee uiteinden.
Je weet welke reads bij elkaar horen (komen uit zelfde fragment uit DNA library): daartussen mis je dus een stuk (stuk in midden wordt niet gesynthetiseerd).
Protocollen compleet anders. voor analyse: belangrijk is dat er bij mate pairs meer afstand tussen de reads zit.
Waarmee kan gekeken worden naar inserties en deleties in het DNA?
Veel complexe elementen van het humane genoom kunnen niet in kaar gebracht worden met short-read paired end sequencing: de onderdelen zijn te lang. Met welke techniek kan dit worden opgelost?
- single-molecule real-time sequencing approaches (bar code library preparation: multiplexing)
- synthetic approaches (rely on existing short-read approaches --> in silico construction)
Waarom is exome sequencing relevant/wat is het doel?
Dus: op zoek naar genvarianten in speficieke protein coderende regio's.
Wat voor varianten kun je identificeren met exome sequencing?
- Single nucleotide polymorphism: punt mutatie dat heeft volstaan in de populatie.
- Indels (insertie/deletie)
Wat is een exon capture? Waarom voeren we dit uit?
- cruciale stap in exome sequencing
- procedure om introns en intergenic regions van het DNA te verwijderen
- daarna kan vervolgd worden met sequencing: waar we dan dus minder van hoeven te doen! (slechts paar procent DNA is eiwit-coderend)
Stel: je hebt een exon capture uitgevoerd? Bevat het DNA dan nog introns? Welke extra info krijgen we zo mee?
bijv wasstap niet helemaal succesvol. of probe neemt nog deel mee.
exome sequencing geeft dus ook inzicht in exome splice sites.
Wat is het resultaat van NGS in exome sequencing? Wat is de vervolgstap?
- Millions of sequence reads! (nog steeds)
- Bioinformatica begint: referentie DNA sequentie nodig, bijv vanuit public data base
- Die hebben we nodig, om een lijst van nucleotide differences tussen patiënt en referentie te verkrijgen.
- Filtering op die lijst toepassen.
- In die lijst willen we alle verschillen die geen experimentele sequencing errors zijn.
Hoe krijg je uit een exome sequencing lijst de juiste SNPs?
- Wegfilteren errors
- SNPs shared between patients. Patienten onderling vergelijken: dan zie je bijv één gen wat in alle patiënten is gemuteerd. --> verder valideren: bioinformatica en terug naar het lab. maar anderen kun je weggooien.
- list of synonymous SNPs: SNPs die het eiwit niet gaan veranderen kun je ook weggooien
Leg uit hoe identificatie van zeldzame en veel voorkomende ziektes werkt via verschillende technieken.
- zeldzaam = high impact --> identificeren via exome seq
- common = low impact --> GWAS. most are in regulatory regions --> geen exome seq
- GWAS: meer kandidaten nodig.
Waarom zijn zeer zeldzame ziekten erg moeilijk te onderzoeken met linkage analysis?
- Zo zeldzaam en zo ernstig dat de mutatie eigenlijk niet wordt doorgegeven aan volgende generatie.
- het zijn dus waarschijnlijk de novo mutaties die ontstaan in de germ line
- dus geen linkage analyse door generaties
- statistisch niet te doen
Dus: argument voor exome sequencing. (+ kosten)
Welke informatie kan meegenomen worden in de analyse bij exome sequencing?
- manier van overerving ziekte (dom/rec)
- of het een de novo mutatie is
- extend of locus heterogeneity: of het door meerdere mutaties wordt veroorzaakt.
- populatiestructuur
Waarom is het makkelijker om recessieve mutatieziekten te identificeren met exome sequencing?
Hoe onderzoek je de novo mutaties?
Voor exome sequencing moet dus een exome capture worden uitgevoerd. Leg de procedure van exome capture uit.
- ontwerpen van capture probes (die zijn complementair aan exonen) (bioinformatica speelt hier een rol in design!)
- ontwikkelingen: steeds meer probes beschikbaar. maar je neemt dus niet per se alles mee. dit is dus ook een probleem. Daarom argument om toch compleet te sequencen, nu dit steeds goedkoper wordt.
- je kunt dit doen via microarray capture (probes zitten vast) en solution capture (probes in oplossing).
Geef 4 mogelijke uitkomsten van alignment procedures.
- alignment op unieke positie --> houden
- alignment op meerdere posities --> weg
- alignment met lage betrouwbaarheid (veel mismatches) --> weg
- geen alignment gevonden (experimentele artefacten) --> weg
Na identificatie van echte SNPs (exome seq) gooi je alle bekende mutaties in dbSNP public databases eruit. Waarom?
Waarom gooi je SNPs die voorkomen in Segmental Duplications (SDs)?
Geef 4 limitaties van exome sequencing.
- technical failure (eg probes)
- filtering kan causale variant verwijderen
- genetische heterogeniteit maakt vinden gen moeilijk
- false positive variants
De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:
- Een unieke studie- en oefentool
- Nooit meer iets twee keer studeren
- Haal de cijfers waar je op hoopt
- 100% zeker alles onthouden
