Startpagina / Samenvattingen / Class notes - OMICS / alignment-reads-data

Next Generation Sequencing (NGS)

Q: Welke long-read technieken zijn er?

1. single-molecule real-time sequencing: hebben geen clonal populatie van geamplificeerde DNA fragmenten nodig voor signaal en ook geen chemische cycling voor elke toegevoegde dNTP. 2. synthetic approaches : gebruiken bestaande short-read technieken om lange reads te maken. Gebruiken barcodes in de library preparation om later kleine fragmenten te assembleren tot een groot fragment.

11 belangrijke vragen over Next Generation Sequencing (NGS)

Wat houdt paired-end (PE) sequencing in?

Hierbij worden beide uiteindes van het DNA fragment gesequenced en de forward en reverse reads worden dan gealigned als read pairs.

* Vergoogt de nauwkeurigheid van reads mapping op het referentie genoom.
* fragment grootte: 200-500 bp
* produceerd 2x zo veel reads voor zelfde tijd en moeite, nauwkeurigere read alignment, kan indels detecteren

Wat houdt ,mate-pair sequencing in?

Het is in prencipe hetzelfde als PE sequencing met als enig verschil hoe de sequence library geproduceerd is. De fragmenten zijn 2-5 kb groot waardoor de reads informatie geven over nucleotides die zich ver van elkaar bevinden bij elkaar horen. Wordt vaak gebruikt voor structural variant (SV) detectie.

Welke long-read technieken zijn er?

1. single-molecule real-time sequencing: hebben geen clonal populatie van geamplificeerde DNA fragmenten nodig voor signaal en ook geen chemische cycling voor elke toegevoegde dNTP.

2. synthetic approaches: gebruiken bestaande short-read technieken om lange reads te maken. Gebruiken barcodes in de library preparation om later kleine fragmenten te assembleren tot een groot fragment.

Wat zijn DNA caputure methoden en welke zijn er?

DNA capture methoden maken gebruik van probes om naar specifieke gedeeltes van het genoom te bekijken (e.g. kankergenen etc.).

1. Microarray capture: de gesynthetiseerde probes zitten vast aan een vast oppervlak. De fragment library wordt dan 'geladen' op de microarray, wat tot hybridizatie van de exon fragmenten aan de complementaire probes leidt (rest wordt weggewassen).

2. Solution campture: zelfde principe, maar probes zitten in oplossing. In dit geval worden de juist fragmenten met beads geselecteerd.

* Probes worden gemaakt aan de hand van referentie sequenties

Voor wat worden Unique Molecular Identifiers (UMIs) gebruikt?

Ze worden gebruikt als absolute tel methode. Hierbij wordt elk molecuul in een populatie eerst uniek gemaakt door het toe te voegen van een UMI. De UMIS in de library zijn dan een moleculaire geheugen van het aantal moleculen in de begin sample. Het aantal begin DNA moleculen kan de bepaald worden door elke UMI 1x te tellen.

* Voorkomt overpresentatie van specifieke sequenties door PCR
* Herkent incorporatie van foute nucleotiden door PCR

- UMIs zorgen voor betere kwantificatie van gen expressie met RNA-seq of verbeterde detectie van low-frequent mutaties

Wat houdt data pre-processing in?

Het klaar maken van de sequence data voor verdere, meer gespecialiseerde, data analyse zoals de identificatie van SNPs, pathway analyse en gen expressie analyse.

Hierbij hoort bijvoorbeeld data conversion, het checken van de kwaliteit en die van de alignment.

Wat houdt data conversion in?

Hierbij wordt raw data geconverteert in een fastq format.

Wat is een fastq format?

Fastq is een text-based format waarin beide biologische sequenties (meestal nucleotide sequenties) en de bijbehorende kwaliteit scores worden bewaard.

Hoe worden de kwaliteit waardes geinterpeteerd?

De sequencing machine produceert naast de sequenties ook nog kwaliteit waardes voor elke nucleotide. Deze worden vaak gegeven in Phred Scores Q ( Q= -logP)

Dus bijvoorbeeld:
Score                  kans incorrecte base                       base call nauwkeurigheid
10                             1 in 10                                                            90%
20                             1 in 100                                                          99%
30                             1 in 1000                                                        99,9%
40                             1 in 10000                                                      99,99%
50                             1 in 100000                                                    99,999%

* De kwaliteit van de calls zal bij de meeste platforms lager worden naarmate de run progress vordert (Hoe verder in de read, des te lager)

Wat kunnen de verschillende uitkomsten zijn van een sequence alignment?

Je kan Blast of BWA gebruiken (BWA is beter en sneller voor de alignment van korte sequentie reads)

1. Unique alignment: ideale situatie. Sequentie is aligned op exact 1 positie van het referentie sequentie.
2. Non-unique alignment: mapped op meerdere posities van referentie sequentie. Kan doordat de sequentie te kort is. (worden vaak weggehaald)
3. Low confidence alignment: een unique alignment maar dan met lage kwaliteit (te veel mismatches met referentie genoom).
4. No alignment

Hoe werken microfluidic devices?

Ze zijn perfect voor single-cell isolatie. Ze maken compartimentalisatie en gecontroleerde beheer van nanolitre reactie mogelijk door gebruik te maken van microfluid chips en gecontroleerde vloeistof stroming.

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

OMICS

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding

Next Generation Sequencing (NGS)

11 belangrijke vragen over Next Generation Sequencing (NGS)

Wat houdt paired-end (PE) sequencing in?

Wat houdt ,mate-pair sequencing in?

Welke long-read technieken zijn er?

Wat zijn DNA caputure methoden en welke zijn er?

Voor wat worden Unique Molecular Identifiers (UMIs) gebruikt?

Wat houdt data pre-processing in?

Wat houdt data conversion in?

Wat is een fastq format?

Hoe worden de kwaliteit waardes geinterpeteerd?

Wat kunnen de verschillende uitkomsten zijn van een sequence alignment?

Hoe werken microfluidic devices?

Samenvattingen die gerelateerd zijn aan Next Generation Sequencing (NGS)

Class notes - OMICS

Oncologie

Class notes - Cellulaire Oncologie

Class notes - OMICS in Biomedical Sciences

Class notes - Startcursus

Class notes - Schade, afweer & herstel

Class notes - Start van het Leven

Class notes - Groei en Ontwikkeling

Class notes - EHO

Class notes - Leeftsijl en Gezondheid

Class notes - Arts&Patient 3