Startpagina / Samenvattingen / Class notes - OMICS / metabolieten-massa-lipiden

Metabolimics

Q: Welke vormen van lipide extractie zijn er en hoe werken ze?

1. Liquid-liquid extraction 2. solid phase extraction Liquid-liquid extraction Maakt gevruik van een two-phase systeem (organisch/waterig) waarbij de lipiden in de organische fase gaan en water oplosbare moleculen in de waterige fase blijven en eiwitten dus worden neergeslagen.

26 belangrijke vragen over Metabolimics

In welke systemen zijn lipids (vetten) werkzaam?

apoptose, cel signalering, ontsteking, immuniteit, inborn errors in metabolisme

Wat moet een metabolomics protocol bevatten?

1. Statistische overwegingen
2. Beschrijving van de collectie van samples
3. Beschrijving van sample bereiding en data acquisitie (de echte metingen)

Wat houdt het experimental design in en wat moet het bevatten?

Vaak heeft het experimental design te maken met beslissingen over het aantal samples, groep grootte (technische & biologische replicanten) en quality control samples.

- Het moet het vermogen hebben om rekening te houden met niet gewilde effecten (experimentele bias) zoals bijvoorbeeld contiminatie van de chromatogram.
--> dit kan worden behaald door bijvoorbeeld randomization & blocking

- Keuzes over de sample collectie (timing, procedure, processing, berging), sample preparatie (extractie, derivatisatie) en analytische methode beinvloeden ook het eindresultaat.

Wat houdt metabolomics data pre-processing in?

- Piek detectie & integratie
- Isotoop correctie
- Normalisatie
- Compound identificatie

Waarom is het moeilijk om een power analyse uit te voeren op metabolomics data?

Vaak is de effect size en variantie van metabolieten over de samples niet bekend van te voren en hangen ze dus van verschillen in metaboliet concentraties af tussen experimentele groepen ( control vs diseased) als van de biologische en technische variaties in dezelfde groep.

Voor wat is de extractie van lipiden nodig?

Het is de eerste stap richting de isolatie, verrijking en concentration en zorgt daarnaast ook voor de verwijdering van zouten en eiwitten.

* Zouten en eiwitten interfereren met scheidings methoden als liquid chromatografie en daardoor ook massa spectronomie analyse.

Welke vormen van lipide extractie zijn er en hoe werken ze?

1. Liquid-liquid extraction
2. solid phase extraction

Liquid-liquid extraction
Maakt gevruik van een two-phase systeem (organisch/waterig) waarbij de lipiden in de organische fase gaan en water oplosbare moleculen in de waterige fase blijven en eiwitten dus worden neergeslagen.

Waarom is het niet mogelijk om het complete lipidoom te meten met een enkele analyse/

Lipide moleculen hebben een hoge complexiteit en fysiochemische diversiteit waardoor het niet mogelijk is om alle lipide soorten in een keer te extraheren.

* Hierdoor moet je kiezen tussen target/optimize (specifiek lipide categorie extraheren) of een meer generalized methode om zo veel mogelijk lipiden te extraheren.

Hoe moet er met de lipiden na extractie gewerkt worden?

Sommige lipiden zijn makkelijk chemisch en enzymatisch te modificeren. Het is daardoor belangrijk om ze bij een temperatuur van -80 C te bewaren.

Na sample homogenisatie zijn de cellulaire inhouden met elkaar gemixt en verdund, waardoor de lipiden nog meer kans hebben op chemische en enzymatische modificatie (chemische oxidatie, oxidatie door licht).

--> Enzymatische modificatie kan voorkomen worden door te werken bij een temperatuur rond de 0 C en het toevoegen van organische oplossing aan de homogenisatie buffer.
--> De lipiden bewaren in glazen buisjes met voldoende organische oplossingsmiddel bij -80 C.

Hoe kunnen lipiden worden gescheiden voordat ze MS analyse ondergaan?

- high/ultra-high performance liquid chromatography (HPLC/UHPLC)
- capillary electrophoresis

* shotgun lipidomics: directe infusie van het lipide extract in de massa spectrometer (dus zonder scheiding)

Welke mass filters zijn er?

1. Quadrupoles (Q)
2. Time-of-flight (TOF)
3. Ion traps

* Een combinatie wordt een hybrid genoemd

Wat is het verschil tussen chemische en instrumentele ruis?

- Chemische ruis: komt van oncontroleerbare variabelen dat de chemische samenstelling van het systeem dat wordt geanalyseerd beinvloedt.
(e.g. variantie in temperatuur, druk, luchtvochtigheid, licht intensiteit etc.)

- Instrumentele ruis: geassocieerd met componenten van het instrument
(e.g input/output transducer, signal processing elementen)

Wat is het verschil tussen MS en NMR?

- Mass spectronomy (MS): meet de massa van de metabolieten door te meten hoe ionen die ervan gevormd worden versneld en afgebogen worden door electrische/magnetische velden.
+ is analytisch gevoelig
+ complexe matrixen (kan meer metabolieten identificeren)
- Identificatie kan soms moeilijk zijn
- Isotopische standaarden zijn nodig voor kwantificatie

- Nuclear Magnetic Resonance (NMR): meet magnetisch bewegingspatroon --> structuur van molecuul
+ Niet destructief (kan in vivo worden toegepast)
+ Vrij makkelijk om compounds te identificeren
+ Kwantificatie zonder standards
- Lage analytische gevoeligheid
- Gelimiteerd tot abudante metabolieten

Wat is het verschil tussen targeted en non-targeted onderzoek?

- Targeted (oud vs jong): kijken naar specifieke groepen metabolieten
    + makkelijk toe te passen
    - biased (je kijkt maar naar 1 groep)

- Non-targeted: zo veel mogelijk metabolieten in een keer
    + unbiased
     - technisch challenging (analyse & bioinformatica)

Hoe werken Quadrupoles/ triple quadrupoles (QqQ)?

Quadrupoles: hebben een lage resolutie, werken door de frequentie te veranderen van elektrisch veld en daarmee te bepalen welke massa's wel/niet worden doorgelaten.
* Worden vaak gebruikt als eerste selectie.

- Triple quadrupole instruments (QqQ): worden vaak gebruikt voor targeted kwantificatie van metabolieten.
De twee quadrupoles (Q) zijn gescheiden door een collision cell (q) die de ionen afkomstig van de eerste quadrupol fragmenteert --> verschillende type scans.
* Wanneer brede massa spectrum wordt gescand, is gevoeligheid heel laag --> niet geschikt voor biomarker identificatie
* Geschikt voor sensitive targeted quantitative analyse van een gelimiteerde hoeveelheid metabolieten (vooral als gecombineerd met UHPLC)

Hoe werkt Time of Flight (TOF)?

- Tijd van de 'vlucht' zegt iets over de grootte van de ionen)
- Hoge resolutie
- Kan werken met een hoge acquisitie snelheid --> combineert goed met snelle chromatografische systemen als UHPLC

Hoe werken ion traps?

- hoogste resolutie
- 'Bewaart' ionen en geeft ze vervolgens beweging mee
- Het is mogelijk om de exacte masssa van een compound te berekenen
- Isotioop fine structure
- Hebben echter wel een relatief lage acquisitie snelheid
- Resolutie wordt minder bij hogere m/z waarden
--> minder geschikt voor snelle chromatografie

Wat is soft ionization?

Ionisatie technieken waarbij er weinig fragmentatie plaats vindt tijdens het ionisatie proces en het produceert voornamelijk monogeladen moleculaire ionen (die ideaal zijn voor metabolomics)

Waarom moeten metabolieten worden gemeteb?

- Metabolieten zijn directe kenmerken van biochemisch activiteit
- Metabolieten worden uit de cel geexporteerd en kunnen dus worden gemeten in lichaamsvloeistoffen als plasma en urine
- "most proximal reporters for phenotype/disease"

Welke metabolieten worden vaak onderzocht bij inborn errors?

Acylcarnitine & aminozuren

Wat zijn de challenges van metabolomics?

- grote verschillen in concentraties van metabolieten
- grote verschillen in fysiochemische eigenschappen (e.g. hydrofoob/hydrofiel, lading, volatiliteit, molecuul massa)

Hoe werkt massa spectronomie?

1. Moleculen worden omgezet in gas-fase ionen en in vacuum gebracht
2. Ionen worden gescheiden op basis van hun m/z waarde door elektromagnetische velden
3. De ionen worden gedetecteerd en het signaal wordt verwerkt in een massa spectrum

Wat is een product ion scan?

- Zegt iets over specifieke massa
1. Fixed electric field (m/z 200)
Selectie modus
2. collision chamber
Fragmentatie
3. Detectie fragmenten

Wat is een precursor ion scan?

Specifiek weten naar welk molecuul je kijkt.

1. scanning mode m/z50-500
2. Collision chamber
3. Fixed m/z 85

Wat is een neutral loss scan?

Delta verschil is bekend (ke weet hoeveel neutraal eraf valt) --> verliest altijd dezelfde neutrale massa. Je wil meten wat niet te ioniseren valt

Wat is isotoop labeling

Tracer-based metabolomics traceren waar moleculen in mechanisme blijven omdat isotopen verschillen van endogene type

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

OMICS

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding