Startpagina / Samenvattingen / Class notes - Practicum minimale cel Celbiologie / trail-eiwit-eiwitten

Celbiologie inleiding

64 belangrijke vragen over Celbiologie inleiding

Waar wordt TRAIL geproduceerd?

In E. Coli dat een plasmide bevat met het gen dat codeert voor het humane TRAIL.

Welke twee soorten TRAIL-varianten gaan we naar kijken?

Een TRAIL variant met His-tag en een TRAIL variant zonder His-tag.

De celcultures moeten worden overnacht, wat gebeurt er daarna?

Nadat de cultures hebben overnacht om verder te groeien, worden de cellen opengebroken (gelyseerd) en wordt TRAIL gezuiverd uit het cellysaat.

Waarmee wordt het TRAIL gezuiverd uit het cellysaat?

Met behulp van een affiniteitskolom.

Waarmee wordt de aanwezigheid van TRAIL aangetoond?

Met SDS-PAGE

Wat wordt er gedaan bij de proef met GFP?

Subcellulaire localisatie met behulp van Green Fluorescent Protein.

Wat wordt er met het te onderzoeken DNA gedaan nadat het is gekoppeld aan DNA dat codeert voor GFP?

Het DNA wordt teruggedacht in de cellen. Zodra het gen voor GFP tot expressie komt, worden eiwitten geproduceerd waaraan GFP vastzit.

Wat kun je zien door het GFP te volgen?

Dankzij het GFP is te volgen wanneer het eiwit gesynthetiseerd wordt en waar, en kan het transport in de cellen gevolgd worden.

Welk DNA wordt tijdens het practicum gebruikt?

Tijdens het practicum wordt DNA coderend voor GFP met of zonder signaalpeptide, ingebracht in HEK293 (Human Embryonic Kidney) cellen.

Hoe wordt DNA coderend voor GFP ingebracht in HEK293 cellen?

Door middel van transfectie.

Wat gebeurt in nadat het DNA coderend voor GFP is ingebracht in HEK293 cellen?

Na enige tijd zullen de HEK293 cellen het eiwit gaan produceren waar GFP aan vast zit. Dit wordt bekeken met een fluorescentie microscoop.

Wat moet je kunnen zien met de fluorescentie microscoop?

Je moet aangeven wat de lokalisatie is van GFP in de celorganellen.

Waar bevinden zich de CO2 blussers?

Naast de gangdeuren

Waar bevindt zich een EHBO kist?

Bij de telefoon en bij het practicumbeheer.

Een cel kan op twee manieren doodgaan; op welke manieren?

1) necrose: de cel gaat abrupt dood. De inhoud van de cel, het cytoplasma, wordt in de omgeving van de cel vrijgelaten (lysatie). Dit activeert het immuunsysteem, waardoor een ontstekingsreactie kan ontstaan.
2) apoptose: georganiseerde manier van celdood. Het is geprogrameerde celdood, omdat er in elke cel mechanismen aanwezig zijn die een gereguleerd afstervingsproces mogelijk maken.

Wanneer gaat een cel in apoptose?

Wanneer er groeifactoren ontbreken of zogenaamde death-receptors worden geactiveerd of wanneer de cel zoveel schade heeft opgelopen, dat een verder bestaan niet mogelijk is.

Apoptose kan via verschillende routes verlopen. Welke routes?

A) de extracellulaire route: TRAIL bindt aan DR4 of DR5, waarna initiator caspase 8 wordt geactiveerd. Uiteindelijk wordt caspase 3 geactiveerd waardoor apoptose geïnduceerd wordt.
B) de intracellulaire route: Bv. DNA schade zorgt voor activatie van caspase 9 en uiteindelijk ook tot activatie van caspase 3.
C) de extracellulaire en intracellulaire route; deze zijn niet strikt gescheiden, er is ook 'cross-talk' mogelijk.

Het activeren van intracellulaire mechanismen leidt tot?

Het leidt tot de activatie van proteases (eiwit-afbrekende enzymen), de zogenaamde caspases (cysteine aspartyl proteases).

De activatie van proteases, de zogenaamde caspases leidt tot?

Deze geactiveerde eiwit-afbrekende enzymen zetten de cel aan tot het afbreken van eiwitten en DNA. De substraten van de caspases zijn verspreid over de cel: in de celkern, het cytoplasma en het cytoskelet.

Een cel die apoptose ondergaat is te herkennen aan een aantal kenmerken, welke?

1) Morgologische kenmerk dat er kleine blaasjes afsplitsen van het cytoplasma (blebbing).
2) Als gevolg van degradatie van het DNA valt bij gel-electroforese een kenmerkende DNA ladder formatie te zien.
3) Cellen die apoptose ondergaan, vertonen negatief geladen fosfolipiden op het celoppervlak. Dit kan door fagocyten worden herkend, waarna de fagocyt de apoptotische cel vernietigd.

Waar leidt verstoring van het apoptoseproces tot?

Een onbalans tussen celgroei en celdood, hetgeen kan leiden tot ziektes als kanker. Bij veel soorten kanker zijn pro-apoptotische eiwitten geïnactiveerd of is de expressie van anti-apoptotische eiwitten juist geupreguleerd. Dit leidt tot ongecontroleerde celgroei van een tumor en het niet meer adequaat reageren op stress, schadelijke mutaties en DNA schade.

Hoe kan een cel tot apoptose worden gedwongen?

Door intracellulaire oorzaken, bv. DNA schade, of door signalen afkomstig van buiten de cel, bv. binding van celdood inducerende eiwitten aan de zogenaamde death receptoren van een cel. Na binding van een celdood inducerend eiwit aan een death-receptor, geeft de receptor aan de cel een signaal door waardoor de cel tot apoptose wordt gedwongen.

Wat bevatten sommige cellen?

Sommige soorten kankercellen bezitten death receptors behorend tot de TNF receptor familie, waaronder de DR4 en DR5 receptoren. Binding van een ligand aan deze receptoren leidt tot apoptose.

Wat kan binden aan een TNF receptor, bv DR4 en DR5?

Het eiwit dat kan binden aan deze receptoren en apoptose kan induceren is het tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand (TRAIL).

Wat is de structuur van TRAIL?

TRAIL is een trimeer (3 monomeren) in complex met drie DR5 receptoren.

Wat is er speciaal aan TRAIL?

De combinatie TRAIL/DR4 en TRAIL/DR5 induceert alleen apoptose in bepaalde types kankercellen en niet in gezonde cellen. De meeste klinisch gebruikte chemoth erapeutica beïnvloeden alle snel delende cellen; dus niet alleen de kankercellen maar ook cellen betrokken bij haargroei en cellen uit de mucosa van het maagdarmkanaal waardoor haaruitval en misselijkheid ontstaan als bijwerkingen van chemotherapie. Door deze selectiviteit voor kankercellen lijkt TRAIL een veelbelovend toekomstig anti-kanker middel.

Wat is er nodig om veel TRAIL-eiwit te kunnen produceren?

cDNA dat codeert voor het humaan TRAIL-eiwit moet d.m.v. recombinant DNA techniek in een bacterieel expressieplasmide worden gebracht.

Wat is een multiple cloning site (MCS) van een plasmide?

Een plek die veel specifieke DNA-sequenties bevat waar restrictie enzymen het DNA kunnen knippen en een gen (in dit geval het gen voor TRAIL) ingeplakt kan worden.

Hoe kan men vaststellen of een bacterie het plasmide echt heeft opgenomen?

Hiervoor is op het plasmide een selecteerbare eigenschap aanwezig. Dit is meestal resistentie tegen een specifiek antibioticum. In ons geval bevat het plasmide een voor het eiwit B-lactamase coderend gen. B-lactamase breekt antibiotica, zoals ampicilline af met een B-lactamring. Wanneer dit ampicilline antibioticum aan het groeimedium is toegevoegd zullen alleen bacteriën met dat plasmide kunnen groeien. In afwezigheid van het antibioticum in het groeimedium zullen ook de bacteriën zonder plasmide overleven en vermenigvuldigen en dus ook geen TRAIL produceren.

Waar zit het voor TRAIL coderende DNA?

Achter een zogenaamde T7 promoter. Aan de T7 promoter kan het T7 RNA polymerase eiwit binden waardoor het gen wordt afgelezen en een mRNA transcript wordt gevormd. Dit mRNA transcript wordt vervolgens door het ribosoom vertaald in het TRAIL eiwit.

Hoe wordt de vorming van T7 RNA polymerase geremd?

Door de aanwezigheid van glucose in het medium wordt de vorming van T7 RNA polymerase geremd en wordt dus geen TRAIL-eiwit geproduceerd.

Waarom wordt isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside (IPTG) toegevoegd?

Nadat de bacterieculture een bepaalde celdichtheid heeft bereikt, wordt IPTG toegevoegd. Hierdoor wordt de productie van T7 polymerase geactiveerd en kan het TRAIL gen worden afgelezen waarna de productie van het TRAIL-eiwit plaatsvindt.

Hoe kan de hoeveelheid bacteriën in het medium worden bepaald?

Door de optische dichtheid (OD) van de culture te meten. Een bacterieculture met een hoge celdichtheid zal meer licht verstrooien dan een culture met een lage celdichtheid. Hoe minder licht er verstrooit wordt, hoe meer licht de detector bereikt, dus hoe hoger de optische dichtheid is. Dus hoe hoger de OD, hoe hoger de celdichtheid.

Hoe kan de optische dichtheid (OD) van een bacterieculture worden beïnvloed?

Door het opgenomen plasmide. Wanneer een ingebouwd gen tot expressie wordt gebracht, vergt dit meer van de bacterie en zal de culture minder hard groeien. Er zal een lagere celdichtheid zijn en hierdoor een lagere OD.

Wat doet het lac repressor eiwit?

Het lac repressor eiwit, gecodeerd door het lacI gen, remt het afschrijven het van T7 promoter op het plasmide en de lac promoter in het genoom van E. coli.

Wat gebeurt er na inductie met IPTG?

Na inductie met IPTG wordt de lac promoter in het genoom van E coli aangeschakeld en wordt er T7 RNA polymerase gevormd. De T7 RNA polymerase bindt vervolgens aan de T7 promoter op het expressie plasmide en het TRAIL-gen wordt afgeschreven. Het gevormde mRNA wordt vervolgens door het ribosoom gebruikt als template voor de eiwitsynthese van TRAIL.

Er is een hoge zuiverheid van het geproduceerde eiwit TRAIL vereist. Wat is hiervoor nodig?

Het geproduceerde TRAIL eiwit dient te worden gescheiden van de overige eiwitten van E coli. Daarvoor moeten eerst de eiwitten uit de bacteriecellen worden vrijgemaakt.

Hoe kunnen eiwitten uit bacteriecellen worden vrijgemaakt?

1) Door het gebruik van hoogfrequentie geluidsgolven (sonificeren).
2) Door de cellen onder hoge druk door een kleine opening te persen (French Press).
3) Door gebruik te maken van bepaalde enzymen (lysozym) en detergentia. Deze methode gebruiken we in dit practicum.
Hierna zullen de eiwitten worden onderworpen aan scheiding en zuivering.

Hoe kan men eiwitten scheiden?

Verschillende eiwitten hebben verschillende fysisch-chemische eigenschappen: verschil in lading (positief geladen, negatief geladen), hydrofobiciteit, grootte. Door gebruik te maken van deze verschillen kunnen eiwitten van elkaar worden gescheiden.

Hoe kunnen we TRAIL zuiveren?

Door gebruik te maken van het verschil in affiniteit van de eiwitten voor metaalionen (in dit geval nikkel; Ni2+). Clusters van het aminozuur histidine hebben een hoge affinitiet voor Ni2+. Door het gen voor TRAIL uit te breiden met extra DNA, krijgt het product een 'staart' die bestaat uit 6 histidines, een 'His-tag'. Hierdoor is het geproduceerde eiwit makkelijk te scheiden van andere eiwitten door gebruik te maken van een kolom (His SpinTrap kolom) die gebonden Ni2+ bevat. Door het eiwitextract over de kolom te halen blijven alleen eiwitten die affiniteit hebben voor Ni2+ aan de kolom hangen.

Welke 4 TRAIL plasmideconstructen gebruiken we in dit practicum?

1) plasmide zonder TRAIL gen
2) plasmide dat codeert voor een TRAIL-gen zonder histag
3) plasmide dat codeert voor het TRAIL eiwit met een N-terminale histag
4) plasmide dat codeert voor een eiwit dat bestaat uit een fusie van het GFP en het TRAIL eiwit.
Ook de TRAIL zonder histag heeft affinitiet voor Ni2+, veroorzaakt door histidines in het TRAIL eiwit zelf die in een goede positie zitten om een Ni2+ bindingsplaats te vormen, maar de affiniteit voor Ni2+ is iets lager dan die van de histag TRAIL variant.

Hoe analyseren we de zuiverheid van het gezuiverde TRAIL en histag TRAIL?

Door middel van een SDS-PAGE gel. Om te testen of de geïsoleerde TRAIL variant een hoog agonistisch effect heeft op de DR4 en DR5 receptor en zo apoptose kan induceren, wordt het effect van het gezuiverde TRAIL en histag TRAIL op humale darmkankercellen (Colo205) getoond. Onder de omkeermicroscoop is het effect van toevoeging van TRAIL goed zichtbaar.

Waar worden de eiwitten door geleid?

De eiwitten worden door een polyacrylamide (PAA) gel geleid, die fungeert als een moluculaire zeef.

Wat is de meest gebruikte uitvoering van SDS-PAGE?

SDS-PAGE met het discontinue buffersysteem volgens Laemmli, dat resulteert in en scherpe scheiding van de eiwitten. Dit komt doordat de eiwitten eerst een zogenaamde stackinggel (stapelen) doorlopen, waarin ze geconcentreerd worden tot een scherpe band, waarna ze de eigenlijke scheidingsgel (runninggel) bereiken, waar de scheiding op molecuulgewicht plaatsvindt.

Welke cultures worden gebruikt in deze proef?

De productiestam E. coli BL21(DE3) zorgt voor de productie van het TRAIL-eiwit. Deze productiestam wordt samengevoegd met één van de volgende plasmiden:
1) pHistagTRAIL (bevat histag TRAIL gen)
2) pTRAIL (bevat het TRAIL gen zonder His)
3) pGFPTRAIL (bevat GFP en het TRAIL gen)
4) pET15b (een lege plasmide).

Wat gebeurt er nog met de stationaire fase?

De aangeleverde cultures bevinden zich in de stationaire fase. De groeicurves van de bacteriecultures is vergelijkbaar met de groeicurve van een plantencelculture. Voor de expressie van eiwitten is het van belang dat de cultures zich in de exponentiële fase bevinden. Daarom worden de cultures uit de stationaire fase eerst 100x verdund met groeimedium en vervolgens 2 uur geïncuveerd. Hierna bevinden de cultures zich midden in de exponentiële fase. De optische dichtheid (OD) bij Y 600 nm (OD600) zal dan ongeveer 0,5 zijn. De OD wordt bepaald met een spectrofotometer.

Waarom moeten eiwitten constant worden aangeleverd in alle cellen, zelfs de cellen die niet delen?

Eiwitten moeten constant worden aangeleverd aan de celorganellen, soms om eiwitten van organellen te vervangen en soms om door de cel gesecreteerd (uitgescheiden) te worden.

Hoe gebeurt de levering van eiwitten?

Aan de mitochondria, chloroplasten, peroxisomen en de celkern gebeurt de levering van eiwitten direct vanuit het cytosol. Levering van eiwitten aan het Golgi apparaat, lysosomen en endosomen gebeurt indirect via het endoplasmatisch reticulum (ER).

Welke drie mechanismen zijn er waardoor een eiwit geïmporteerd worden in een organel?

1) Eiwitten naar de celkern worden geïmporteerd via de kernporiën. Deze vormen openingen in de dubbele membraan die de kernenvelop vormt.
2) Eiwitten naar het ER, mirochondria, chloroplasten of peroxisomen worden getransporteerd door eiwittranslocators. Dit zijn eiwitcomplexen die zich in de membranen van deze organellen bevinden.
3) Eiwitten die van het ER naar andere organellen gaan, worden getransporteerd door transportblaasjes (vesicles), die zich van het membraan afsnoeren en gevuld zijn met eiwitten.

Wat geeft aan naar welk organel het eiwit getransporteerd moet worden?

Een 'sorting signal' in het eiwit zelf dient als een soort adressering. Zo'n signaal is meestal 15-60 aminozuren lang. Dit sorting signal wordt meestal verwijdert nadat het eiwit op de plaats van bestemming is aangekomen.

Welk sorting signal zorgt ervoor dat een eiwit van het cytosol naar de kern gaat?

Het 'nuclear localization signal' (nls) zorgt ervoor dat een eiwit van het cytosol naar de kern gaat. Het bestaat uit een of twee korte sequenties die verscheidene positief geladen lysines of arginines bevatten.

Wat moet er gebeuren om eiwitten in cellen te kunnen volgen?

De eiwitten in cellen moeten zichtbaar gemaakt worden. Dit kan door een groen fluorescerend eiwit (Green Fluorescent Protein GFP), aan het eiwit te koppelen.

Hoe kun je GFP koppelen aan een eiwit in een cel?

Om een fusie-eiwit te krijgen, wordt het gen dat codeert voor het te onderzoeken eiwit gekoppeld aan het gen voor GFP. Vervolgens wordt dit DNA in de cellen gebracht. Dankzij het GFP is te volgen wanneer het eiwit gesynthetiseerd wordt en waar in de cel.

Wat is GFP en waar komt het vandaan?

GFP is een klein eiwit (26,9 kDa) dat oorspronkelijk uit kwallen komt.

Uit welke kwal komt GFP?

De kwal Aequoria victoria geeft groen licht, afkomstig van GFP.

Wat is de structuur van GFP?

De structuur van het eiwit bestaat uit een zogeheten B-barrel. Deze vormt een soort kooi om de fluorofoor (het gedeelte dat licht geeft). Hierdoor is de fluorofoor minder kwetsbaar.

Waarom is het onderzoeken van de juiste lokalisatie van een eiwit van belang?

Het is van belang in het genomics onderzoek, waarbij de functie van een nieuw gevonden gen nog niet bekend is. Verder speelt deze techniek ook een rol bij het onderzoek naar gentherapie. Met behulp van het GFP-label kan worden onderzocht of het beoogde therapeutische eiwit op de juiste lokatie in de cel aangemaakt wordt.

Hoe komt DNA over het celmembraan?

DNA heeft een negatieve lading, net als het celmembraan. Deze twee zullen elkaar dus afstotoen. Om DNA toch een cel in te krijgen gebruikt men chemische verbindingen die door complexvorming bepaalde eigenschappen van het DNA molecuul veranderen zodat het het membraan kan passeren. Eenmaal het membraan gepasseerd, wordt een plasmide door intracellular trafficking via microtubuli naar de kern gebracht. Dit proces moet snel verlopen anders wordt het plasmide afgebroken.

Wat is een veelgebruikte methode om eukaryote cellen te transfecteren?

De calciumfosfaat methode.

Wat zijn voordelen van de calciumfosfaat methode?

De methode is eenvoudig, gebruikt goedkope ingrediënten en werkt voor verschillende celtypen.

Wat is een nadeel van de calciumfosfaat methode?

Grote zoutprecipitaten kunnen celdood veroorzaken.

Hoe kan men zien of transfectie gelukt is?

Om na te gaan of een bepaalde transfectie gelukt is, en om de efficiëntie van transfectie te bepalen, gebruikt men vaak een plasmide met het GFP-gen als positieve controle. Als men onder de fluorescentiemicroscoop groene cellen ziet, kan men ervan uitgaan dat ook de andere plasmiden in de cellen terechtgekomen zijn.

Welke celculture gebruiken we in het experiment met GFP?

In dit experiment gebruiken we een celculture van HEK293 (Human Embryonic Kidney) cellen. Dit is een cellijn die al vele jaren voor celbiologisch onderzoek wordt gebruikt. Ze zijn zeer makkelijk transfecteerbaar.

Onder welke condities wordt het experiment met GFP uitgevoerd?

Onder ML-1 condities, omdat gewerkt wordt met genetisch gemodificeerde organismen.

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

Practicum minimale cel Celbiologie

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding